Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Preparazione di soluzioni di dissezione e liquido cerebrospinale artificiale
- Carbogenato di acqua ultrapura (che è acqua filtrata con una resistività di 18,2 MΩ·cm) con carbogeno (95% O2/5% CO2) per 5 minuti utilizzando diffusori di bolle di pietra porosa (aeratori per acquari).
nota: Le pietre porose possono essere collegate all'erogatore del serbatoio del carbogeno tramite un tubo in silicone standard. Se le pietre porose non sono disponibili, sigillare l'estremità del tubo in silicone e praticare piccoli fori nella guarnizione per consentire al gas carbogeno di fuoriuscire e carbogenare la soluzione.
- Preparare una soluzione di dissezione sciogliendo i soluti della Tabella 1 in acqua ultrapura. Aggiungere CaCl2 a una soluzione che è stata carbogenata per almeno 5 minuti per aiutarla a dissolversi.
nota: In alternativa, aggiungere prima CaCl2, in modo che possa dissolversi facilmente in una soluzione insatura. La soluzione, in forma liquida, dovrebbe essere di 300 - 320 mOsm/L e avere un pH di 7,4 dopo essere stata satura di carbogeno.
- Raffreddare la soluzione di dissezione a 0 - 4 °C. Lasciare la soluzione in frigorifero per una notte o mettere la soluzione in congelatore per 1 ora e monitorare continuamente la temperatura.
nota: La soluzione di dissezione può essere conservata per un massimo di 3 notti; Scartare in seguito.
- Carbogenare la soluzione di dissezione per 5 - 10 minuti prima dell'uso.
nota: Idealmente, la soluzione dovrebbe apparire come granita o passare alla fanghiglia prima dell'uso.
- Preparare il liquido cerebrospinale artificiale per roditori (ACSF) sciogliendo i soluti della Tabella 2 in acqua ultrapura. Carbogenare la soluzione di ACSF mentre è in un bagno d'acqua riscaldato a 35 °C fino al momento dell'uso. Aggiungere CaCl2 a una soluzione che è stata carbogenata per almeno 5 minuti per aiutarla a dissolversi.
nota: In alternativa, aggiungere prima CaCl2 in modo che possa dissolversi più facilmente in una soluzione insatura. La soluzione, in forma liquida, dovrebbe essere 290 - 320 mOsm/L e avere un pH di 7,4 dopo essere stata satura di carbogeno. Le soluzioni dovrebbero essere realizzate in volumi da 1, 2 o 4 L a seconda della durata degli esperimenti. Prepara 4 L per un'intera giornata (8 ore) di esperimenti. L'ACSF dovrebbe essere rinnovato ogni giorno; Non conservarlo per più di 1 giorno.
2. Dissezione del topo per raccogliere il tessuto cerebrale
- Raccogli tutti gli strumenti e i materiali necessari per le dissezioni degli animali. Configura l'area di lavoro per prepararti alle dissezioni degli animali.
- Controllare il serbatoio del carbogeno (95% O2/5% CO2) per assicurarsi che non sia vuoto. Sostituire la bombola del gas prima degli esperimenti se la pressione residua è inferiore a 500 psi.
- Calibrare il vibratomo (affetta tessuti a lama vibrante) secondo il manuale di istruzioni del produttore. Regolare l'impostazione del vibratomo in modo che abbia un'ampiezza di taglio di 1 mm e una velocità di taglio di 0,12 mm/s.
nota: Le impostazioni ottimali possono differire per ogni singola taglierina a lama vibrante per tessuti; Tuttavia, in generale, l'ampiezza dovrebbe essere elevata e la velocità di taglio dovrebbe essere bassa.
- Riempi la camera di incubazione della fetta di cervello (cioè il custode della fetta di cervello) con ACSF e bollezzala con carbogeno. Porre quindi la camera di incubazione in un bagno d'acqua a 35 °C.
- Procurati un topo giovane di entrambi i sessi, di età compresa tra 13 giorni (p13) e 21 giorni (p21, dove p0 è la data di nascita).
- Anestetizzare il topo con un'iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico (55 mg/kg di peso corporeo). Una volta che il topo è profondamente anestetizzato, come indicato dall'assenza del riflesso di pizzicamento delle dita, utilizzare prontamente uno strumento a ghigliottina approvato dal veterinario per decapitare il topo con un movimento rapido><.
nota: Preparare l'iniezione di pentobarbital sodico secondo le procedure raccomandate dalle linee guida istituzionali.
- Tieni il naso del topo per stabilizzare la testa decapitata e fai delicatamente un'incisione sulla linea mediana iniziando tra gli occhi del topo e lungo l'intera lunghezza del cuoio capelluto per esporre il cranio. Assicurarsi che il cranio non sia compresso dalla pressione applicata dal rasoio. Usa l'angolo del filo del rasoio per aumentare la precisione del taglio.
- Allarga i lembi del cuoio capelluto del topo usando le dita per esporre il cranio. Quindi, usa l'angolo fresco del filo di un rasoio per praticare un'incisione lungo la linea mediana del cranio; Prestare particolare attenzione per evitare qualsiasi contatto con la corteccia cerebrale.
- Inserire una pinza per schegge nelle orbite oculari del topo per stabilizzare la testa decapitata e metterla in una capsula di Petri riempita con soluzione di dissezione fredda (0 - 4 °C). Assicurarsi che la testa sia completamente immersa nella soluzione di dissezione.
- Usa una seconda serie di pinze per schegge per staccare delicatamente il cuoio capelluto del topo, rimuovi l'osso del naso staccandolo e rimuovi la parte posteriore (lato caudale) del cranio.
nota: L'osso del naso dei topi giovani è molto morbido e si rompe facilmente.
- Usa una micro spatola per tagliare i nervi ottici, i nervi trigemino e il midollo spinale. Quindi, usa la micro spatola per separare delicatamente il cervello dal cranio. Lasciare il cervello completamente immerso nella capsula di Petri riempita con la soluzione di dissezione.
3. Preparazione di fette corticali dalla corteccia somatosensoriale-motoria
- Riempire il vassoio tampone del vibratomo con ~150 mL di soluzione di dissezione fredda (0 - 4°C).
nota: Facoltativamente, conservare la vaschetta tampone nel congelatore fino al momento del bisogno per mantenere una temperatura bassa durante la procedura di affettatura.
- Incollare il tessuto cerebrale del topo sul tavolino del vibratomo (portacampioni/vassoio) utilizzando la colla adesiva istantanea. Per i topi, tagliare una piccola porzione caudale del cervello (cioè il cervelletto) in modo che possa essere facilmente incollata sul supporto del campione (permettendo al lato rostrale del cervello di essere rivolto verso il soffitto).
nota: In alternativa, è possibile preparare fette orizzontali di cervello di topo incollando il lato dorsale del cervello sul portacampioni (il lato ventrale del cervello deve essere rivolto verso il soffitto).
- Posizionare delicatamente il portacampioni (con il tessuto cerebrale) nel vassoio del tampone. Assicurati che la parte dorsale del cervello sia rivolta verso la lama del vibratomo.
nota: È fondamentale ridurre al minimo la quantità di tempo in cui il cervello è esposto all'aria.
4. Sezionamento e raccolta del tessuto cerebrale
- Taglia il cervello in fette spesse 450 μm usando il vibratomo in direzione dorsale e ventrale. Assicurarsi che il cervello rimanga completamente ancorato al vassoio dei campioni durante l'affettamento.
- Fai il primo taglio nel cervello del topo per rimuovere il bulbo olfattivo. Quindi, eseguire i tagli successivi fino a quando non si osserva l'area somatosensoriale-motoria (situata approssimativamente a metà strada tra il bulbo olfattivo e il bregma).
nota: Facoltativamente, tagliare il cervello in fette più sottili (200 μm) fino a quando il corpo calloso appare nella vista coronale del cervello, il che indica che l'area somatosensoriale-motoria è vicina.
- Utilizzare una pipetta di trasferimento a foro largo per raccogliere le fette coronali (450 μm) che contengono l'area somatosensoriale-motoria e immergerle in una piastra di Petri contenente una soluzione di dissezione fredda (0 - 4 °C).
- Usa una nuova lama di rasoio e taglia il tessuto in eccesso dalle fette. Per le fette coronali di topi, eseguire un taglio trasversale appena sotto la commessura neocorticale (cioè il corpo calloso). Non tagliare con un movimento di segatura; Basta applicare una pressione sulla lama nel tessuto e utilizzare un pennello per dettagli per separare delicatamente il tessuto. Assicurati di ridurre al minimo il movimento della fetta coronale.
- Utilizzare una pipetta di trasferimento a foro largo per trasferire la porzione dorsale delle fette coronali che contengono la neocorteccia (strato 1 - 6) in una seconda piastra di Petri riempita con ACSF caldo (35 °C) per un momento (~1 s). Quindi, trasferire prontamente le fette in una camera di incubazione contenente ACSF.
caldo (35 °C)
nota: Lo scopo del trasferimento nella piastra di Petri con ACSF è quello di ridurre al minimo il trasferimento della soluzione di dissezione nella camera di incubazione durante il trasferimento di fette di cervello con la pipetta a foro largo. Utilizza i pozzetti multipli della camera di incubazione per mantenere organizzate diverse fette di cervello.
- Scartare il resto del cervello e la carcassa animale secondo le linee guida istituzionali.
5. Incubazione e mantenimento
- Lasciare le fette di cervello leggermente immerse nella camera di incubazione a 35 °C per 30 minuti. Quindi, rimuovere la camera di incubazione dal bagnomaria e lasciarla tornare a temperatura ambiente (20 - 25 °C). Attendere 1 ora affinché le fette di cervello si riprendano prima di eseguire registrazioni elettrofisiologiche.
nota: Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria che si accumulano sotto le fette di cervello nella camera di incubazione. Le bolle d'aria sono interfacce d'aria che causano danni ai tessuti. Le fette di cervello di topo possono essere mantenute per 6-8 ore in una camera di incubazione ben carbogenata con ACSF.
6. Registrazioni elettrofisiologiche dello strato corticale superficiale
Nota: Gli eventi ictali vengono osservati nelle registrazioni del potenziale di campo locale extracellulare (LFP) da fette di cervello. L'LFP della fetta cerebrale può essere osservato e registrato con una camera di interfaccia o con un sistema di array multi-elettrodo (MEA) sommerso.
- Usa una pipetta di trasferimento a foro largo o uno spazzolino per dettagli per spostare una fetta di cervello su una carta per lenti pretagliata leggermente più grande che viene tenuta in posizione con una pinzetta dentale. Trasferisci la carta dell'obiettivo (su cui poggia la fetta di cervello) nella camera di registrazione e fissala in posizione con uno schermo ad arpa.
- Far scorrere a caldo (35 °C) il perfusato ACSF carbogenato attraverso la camera di registrazione sopra la fetta di cervello a una velocità di 3 mL/min (~1 gocciolamento/s). Utilizzare un termometro digitale per assicurarsi che la camera di registrazione sia a 33 - 36°C.
- Estrarre gli elettrodi di vetro con un'impedenza di 1 - 3 MΩ dal tubo di vetro borosilicato (con un diametro esterno di 1,5 mm) utilizzando un estrattore. Riempire gli elettrodi di vetro con ACSF (~10 μL) utilizzando una siringa Hamilton. Gettare immediatamente l'elettrodo se la punta è danneggiata.
nota: Sbiancare il filo d'argento (5 minuti) e lasciare che solo una minima parte (cioè la punta) del filo d'argento venga immersa negli elettrodi di vetro riempiti con retro ACSF per ridurre al minimo il rumore e la deriva durante le registrazioni. Se necessario, rimuovere l'eccesso di ACSF dall'elettrodo di vetro con una siringa Hamilton.
- Utilizzare uno stereomicroscopio 20X per guidare con precisione l'elettrodo di vetro di registrazione nello strato corticale superficiale (2/3) utilizzando manipolatori manuali. Registra/visualizza l'attività elettrica della fetta di cervello su un computer con software standard.
nota: Fette di cervello vitali (di alta qualità) mostreranno un robusto potenziale evocato in risposta agli stimoli elettrici applicati (100 μs, 30 - 300 μA) o agli impulsi luminosi (30 ms, 10 mW/mm2) per il tessuto optogenetico.
7. Induzione di attività simili a crisi epilettiche
- Perfondere ACSF contenente 100 μM di 4-amminopirimidina (4-AP) sulla fetta di cervello. Sciogliere 80 mg di 4-AP in 8,5 mL di acqua per ottenere una soluzione madre di 100 mM di 4-AP. Aggiungere 100 μL di 100 mM di soluzione madre 4-AP a 100 mL di ACSF per ottenere un ACSF perfusato con 100 μM di 4-AP.
nota: In alternativa, utilizzare Zero-Mg2+ ACSF (Tabella 3), una soluzione modificata di ACSF che non contiene Mg2+ aggiunti, per perfondere la fetta di cervello. Il tempo medio per la comparsa degli eventi ictali è di 15 minuti; Tuttavia, potrebbero essere necessari fino a 40 minuti per alcune fette di cervello.
8. Generazione di crisi epilettiche su richiesta: una strategia optogenetica per topi optogenetici
- Applicare un breve impulso (30 ms) di luce blu (470 nm) (con un'intensità di uscita minima di 1 mW/mm2) per avviare un evento ictal. Utilizzare un manipolatore manuale per posizionare una fibra ottica con diametro del nucleo di 1.000 μm (0,39 NA) direttamente sopra la regione di registrazione.
nota: Impostare la frequenza della fotostimolazione in modo che corrisponda alla frequenza desiderata di occorrenza dell'evento ictale (ad esempio, 1 impulso ogni 50 s). Tuttavia, il tasso non può essere eccessivamente esagerato rispetto al tasso intrinseco con cui si verificano gli eventi ictali.
Tabella 1: Ricetta per la soluzione di dissezione.Queste sono le istruzioni per realizzare volumi da 1 L o 2 L. MW = il peso molecolare del soluto.
| # | Reagente | Conc. [mM] | MW (g/mol) | 1L (g) | 2L (g) |
| 1 | saccarosio | 248 | 342,3 | 84,89 | 169,78 |
| numero arabo | Bicarbonato di sodio (NaHCO2) | 26 | 84.01 | 2.18 | 4.37 |
| 3 | Destrosio (D-glucosio) | 10 | 180,16 | 1.8 | 3.6 |
| 4 | Cloruro di potassio (KCl) | numero arabo | 74,55 | 0,15 | 0,3 |
| 5 | Solfato di magnesio (MgSO4·7H2O) | 3 | 246,47 | 0,74 | 1.48 |
| 6 | Sodio fosfato monobasico monoidrato (H2NaPO4·H2O) | 1.25 | 137,99 | 0,17 | 0,34 |
| 7 | Cloruro di calcio (CaCl2·2H2O) | 1 | 147,01 | 0,15 | 0,29 |
Tabella 2: Ricetta per il liquido cerebrospinale artificiale per roditori (ACSF).Queste sono le istruzioni per realizzare volumi da 2 L o 4 L. MW = il peso molecolare del soluto.
| # | Reagente | Conc. [mM] | MW (g/mol) | 2L (g) | 4L (g) |
| 1 | Cloruro di sodio (NaCl) | 123 | 58,4 | Ore 14.37 | 28.73 |
| numero arabo | Bicarbonato di sodio (NaHCO2) | 26 | 84.01 | 4.37 | 8.74 |
| 3 | Destrosio (D-glucosio) | 10 | 180,16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | Cloruro di potassio (KCl) | 4 | 74,55 | 0,6 | 1.19 |
| 5 | Solfato di magnesio (MgSO4.H.2 O) | 1.3 | 246,47 | 0,64 | 1.28 |
| 6 | Sodio fosfato monobasico monoidrato (HNaPO4·H2O) | 1.2 | 137,99 | 0,33 | 0,66 |
| 7 | Cloruro di calcio (CaCl2·2H2O) | 1.5 | 147,01 | 0,44 | 0,88 |
Tabella 3: Ricetta per liquido spinale cerebrale artificiale per roditori Zero-Mg2+ (Zero-Mg2+ ACSF).Queste sono le istruzioni per realizzare volumi da 2 L o 4 L. MW = il peso molecolare del soluto.
| # | Reagente | Conc. [mM] | MW (g/mol) | 2L (g) | 4L (g) |
| 1 | Cloruro di sodio (NaCl) | 123 | 58,4 | Ore 14.37 | 28.73 |
| numero arabo | Bicarbonato di sodio (NaHCO2) | 26 | 84.01 | 4.37 | 8.74 |
| 3 | Destrosio (D-glucosio) | 10 | 180,16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | Cloruro di potassio (KCl) | 4 | 74,55 | 0,6 | 1.19 |
| 5 | Solfato di magnesio (MgSO4.H.2 O) | Nominalmente gratuito | 246,47 | 0 | 0 |
| 6 | Sodio fosfato monobasico monoidrato (HNaPO4·H2O) | 1.2 | 137,99 | 0,33 | 0,66 |
| 7 | Cloruro di calcio (CaCl2·2H2O) | 1.5 | 147,01 | 0,29 | 0,59 |