Stabilire un modello di crisi epilettica indotta da pentilenetetrazolo nei topi

Abstract

Fonte: Shimada, T., et al. Modello murino di accensione indotto da pentilenetetrazolo. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video mostra il processo di induzione dell'epilessia nei topi utilizzando iniezioni di pentilenetetrazolo (PTZ), un antagonista del recettore GABA-A. La somministrazione intraperitoneale ripetuta di PTZ abbassa progressivamente la soglia delle crisi inibendo l'afflusso di ioni cloruro, interrompendo la neurotrasmissione inibitoria e portando all'ipereccitabilità nei neuroni che scatenano le convulsioni. Questo processo provoca l'accensione e lo sviluppo di convulsioni spontanee, imitando l'epilessia cronica.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione di Pentylenetetrazole (PTZ)

1. Sciogliere 2 mg/mL di PTZ in NaCl sterile allo 0,9% (p/v). Preparare PTZ il giorno dell'uso.

2. Iniezione di PTZ

1. Eseguire tutti gli esperimenti tra le 9:00 e le 12:00.
2. Misura il peso corporeo dell'animale.
3. Posizionare l'animale in una camera di osservazione per l'assuefazione.
4. Durante il periodo di assuefazione (3 min), calcolare il volume della soluzione PTZ per l'iniezione in base al peso corporeo dell'animale e alla dose di iniezione precedentemente determinata.
   NOTA: Ad esempio, quando si utilizzano 35 mg/kg di PTZ, sono necessari 0,875 mg di PTZ per un topo di peso di 25 g (35 mg/kg x 0,025 kg = 0,875 mg). Pertanto, devono essere iniettati 437,5 μL di una soluzione PTZ da 2 mg/mL (0,875 mg / 2 mg/mL = 0,4375 mL). La dose iniettabile di PTZ dipende dal genotipo e dal ceppo del topo. Per i topi C57BL/6 wild-type, per la prima prova si raccomanda una dose di 30-35 mg di PTZ/kg di peso corporeo. La sensibilità al PTZ dipende dal ceppo di topo utilizzato. La dose iniettabile varia a seconda dello scopo dell'esperimento.
5. Iniettare PTZ per via intraperitoneale con una siringa da 1 ml collegata a un ago calibro 27 nel quadrante sinistro o destro dell'addome dell'animale. Evitare l'iniezione sulla linea mediana.
   1. Evitare iniezioni ripetute nella stessa posizione.
6. Osservare i comportamenti degli animali per 30 minuti dopo la somministrazione di PTZ (Figura 1A) e classificare e valutare il comportamento anomalo come mostrato di seguito. Se possibile, tenere gli animali sotto osservazione per 24 ore, o almeno altre 6-10 ore dopo l'iniezione, soprattutto una volta che il punteggio di gravità delle crisi raggiunge 3 o superiore.
   1. Notare eventuali convulsioni lievi o cambiamenti comportamentali negli animali oltre il periodo di osservazione di 30 minuti. Questo periodo di osservazione prolungato può affrontare un effetto particolarmente importante e completo di una dose subconvulsivante di PTZ nella generazione di crisi epilettiche croniche non provocate.
   2. Inoltre, misurare la durata della crisi di ciascuna crisi osservata poiché le variazioni della durata della crisi si riferiscono alla gravità della crisi. Inoltre, la latenza alla prima crisi dopo l'iniezione di PTZ è un'altra misura importante da raccogliere. Il monitoraggio della frequenza, della durata e della latenza delle crisi è fondamentale per qualsiasi studio molecolare post-crisi.
7. Iniettare PTZ a giorni alterni (Figura 1A). Il numero di iniezioni dipende dall'obiettivo dell'esperimento. Esempi rappresentativi sono i seguenti.
   1. Per generare animali completamente accesi, una volta che un animale sperimenta una crisi con un punteggio di 5 (crisi tonico-clonica), terminare l'iniezione entro altre tre somministrazioni. In questo caso, aumentare la dose di iniezione se il punteggio delle convulsioni non aumenta per tre somministrazioni consecutive. Ogni animale può ricevere un numero e una dose diversi di iniezioni di PTZ.
   2. Fissare il numero e la dose di iniezione di PTZ in ogni condizione per valutare la vulnerabilità al PTZ, anche nelle valutazioni dei farmaci antiepilettici e negli studi del fenotipo dei topi geneticamente modificati. somministrare a tutti gli animali lo stesso numero di iniezioni di PTZ; Si raccomandano in totale da 8 a 12 iniezioni. Se un animale muore, il punteggio delle convulsioni dovrebbe essere indicato come 6.
   3. Determinare la dose di iniezione necessaria per mantenere un punteggio di crisi elevato (4 o 5) per 10 o più iniezioni per studiare i cambiamenti istopatologici che si verificano nelle crisi epilettiche. In questo caso, il numero totale di iniezioni dovrebbe variare da 25 a 30. Diminuire la dose di iniezione se il punteggio delle convulsioni raggiunge 5. Se il punteggio delle crisi scende a 3 o meno, aumentare la dose di iniezione.

Risultati

Figura 1: Breve descrizione del protocollo. (A) Illustrazione schematica dell'accensione mediata da PTZ. (B) Illustrazioni di comportamenti animali rappresentativi per i rispettivi punteggi di crisi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Pentylenetetrazole	Sigma-Aldrich	P6500
Cloruro di sodio	MANAC	7647-14-5
Mouse	CLEA Giappone		C57Bl/6NJcl, postnatale 8 settimane, maschio
Siringa (1mL)	Terumo	SS-01T
Ago (27G x 3/4") (0,40 x 19 mm)	Terumo	NN-2719S
Bilancia	Mettler	PE2000	Questo articolo è un prodotto fuori produzione. Quasi equivalente a FX-2000i con FXi-12-JA della società A&D.