Indurre l'ischemia attraverso l'occlusione dell'arteria carotide media e comune in un modello di ratto

Abstract

Fonte: Wayman, C. et al., Esecuzione permanente di cerebrale medio distale con occlusione dell'arteria carotide comune in ratti anziani per studiare l'ischemia corticale con disabilità sostenuta. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video mostra la procedura di esecuzione dell'occlusione permanente dell'arteria cerebrale media distale, o MCAO, con l'arteria carotide comune, o legatura CCA, nei ratti anziani per modellare l'ictus ischemico. Questo blocca il flusso sanguigno al cervello, portando alla morte neuronale e generando un modello per studiare i meccanismi dell'ictus e i potenziali trattamenti.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Chirurgia

1. Utilizzare ratti anziani femmina con cappuccio di Lister a 16-18 mesi (da 250 a 400 g) e indurre l'anestesia con isoflurano al 5% in 1,5 L/min O₂. Dopo l'induzione dell'anestesia, ridurre il livello di isoflurano e mantenerlo a una profondità adeguata ma minimizzata per l'intervento chirurgico (e.g., 1,5-2%). Somministrare l'anestesia all'animale tramite una maschera facciale e utilizzare un sistema di lavaggio per limitare l'esposizione del chirurgo all'isoflurano.
   1. Eseguire tutte le procedure fino alla craniotomia su animali fittizi, ma esclusa, poiché questa procedura può produrre deficit comportamentali. Considerare gli obiettivi sperimentali quando si progettano esperimenti di occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) e decidere se includere o meno un gruppo fittizio da controllare per la craniotomia.
2. Somministrare sollievo dal dolore prima o perioperatoriamente (Carprieve, 0,25 mg/kg, s. taglio).
   1. Aggiungere da 1 ml a 19 ml di soluzione fisiologica sterile allo 0,9% per ottenere la soluzione madre e iniettare 0,6 ml per ratto da 300 g. L'uso di Carprieve è preferito al Carprofene perché il primo è stabile a temperatura ambiente (RT).
3. Radere il pelo sulla regione ventrale del collo e sulla regione temporale dell'emisfero destro per esporre la pelle. Disinfettare i siti chirurgici utilizzando tamponi a base di etanolo.
   1. Eseguire questo passaggio lontano dall'area operativa per ridurre al minimo la quantità di pelo nel sito di incisione.
4. Posiziona il topo su una bacheca di sughero coperta da un telo sterile in posizione supina su un termoforo. Applicare la crema alla lidocaina sulle regioni rasate della testa e del collo. Inserire una sonda rettale per monitorare e mantenere la temperatura dell'animale tra 36,5-37,5 °C con un sistema omeotermico.
   1. Metti l'unguento lacrilube sugli occhi per prevenire la secchezza. Iniettare nel ratto una soluzione di atropina solfato (0,05 ml di una soluzione da 600 μg/ml, per via sottocutanea) per ridurre le secrezioni tracheali.
      NOTA: I ricercatori dovrebbero prendere in considerazione la misurazione di variabili fisiologiche come i gas ematici e la pressione.
5. Prima di iniziare l'intervento chirurgico, controllare il ritiro del pizzico della zampa posteriore e i riflessi dell'ammiccamento per confermare l'anestesia completa.
6. Al microscopio da dissezione, praticare un'incisione centrale della linea mediana di 2 cm sul collo esposto utilizzando un bisturi. Muovere delicatamente le ghiandole salivari lateralmente alla trachea su entrambi i lati.
7. Sutura in seta ad anello non assorbibile attorno alla pelle che sovrasta l'arteria carotide comune su un lato. Estrarre delicatamente la pelle dal sito usando la sutura di seta e attaccarla alla bacheca usando del nastro chirurgico per rivelare l'arteria carotide comune. Sezionare con cura le arterie libere dalla fascia circostante e dai nervi vagali utilizzando una pinza fine.
   1. Fai attenzione a non danneggiare il muscolo o i nervi vago durante questo passaggio, poiché ciò comprometterà l'alimentazione, la deglutizione e la respirazione.
8. Una volta esposta l'arteria carotide comune, utilizzare una sutura di seta non assorbibile (5/0) per isolare la carotide, separando prima la carotide dal nervo vago mediante dissezione inversa con una pinza fine e facendo attenzione a non entrare in contatto con il nervo. Una volta che il vaso è stato avvolto (ma non legato) con la sutura, fissare insieme le estremità della sutura con del nastro chirurgico per evitare che questo passaggio venga annullato. Rimuovere i punti di sutura che trattengono la pelle sovrastante.
9. Ripeti per l'altro lato.
10. Posizionare una garza sterile imbevuta di soluzione salina nella ferita per mantenere i tessuti umidi durante il resto dell'intervento. Sutura liberamente la pelle e posiziona un'ulteriore garza imbevuta di soluzione salina sull'area per prevenire un'ulteriore disidratazione.
11. Metti i ratti in posizione laterale e fai un'incisione nella pelle nel punto medio tra l'orbita destra e il canale uditivo esterno. Ritrarre la pelle utilizzando fino a cinque divaricatori elastici da 3 mm appuntati sulla bacheca di sughero e quindi sezionare con uno smusso il muscolo temporale per rivelare il cranio.
12. Posizionare una flebo salina azionata dalla gravità regolata dalla rotella sopra il sito aperto (portata di circa 2 ml/min) e impostare un sistema di aspirazione per rimuovere i detriti ossei e per eliminare il sanguinamento minore dal sito esposto durante questa fase dell'intervento.
    1. Posizionare l'ugello di erogazione della soluzione salina nel punto più alto del cranio vicino all'orecchio e l'ugello dell'aspiratore nel punto più basso. Regolare la ruota durante le emorragie per fornire più soluzione salina all'area per visualizzare meglio la fonte di qualsiasi sanguinamento per la cauterizzazione del vaso, riducendo la quantità di tempo in cui gli animali sono sotto anestesia.
13. Eseguire una craniotomia sulla regione esposta (circa 5 mm x 5 mm) utilizzando un trapano dentale con una fresa grossolana diamantata da 1,6 mm a circa 8.000 giri/min, garantendo l'applicazione di una pressione circolare e laterale e non una pressione verso il basso durante la perforazione dell'area esposta. Una volta che l'osso è abbastanza sottile da sembrare completamente trasparente, rimuovilo usando una pinza.
14. Usa un uncino durale fatto in casa, fatto piegando una punta di una pinza sottile di circa 180° per formare un arco, per aprire con cura la dura, facendo attenzione a evitare i grandi vasi sanguigni superficiali, poiché sono delicati e facili da rompere.
    NOTA: L'area esposta del cervello rivelerà l'arteria cerebrale media (MCA); il segmento desiderato misura circa 2 mm di lunghezza (vedi Figura 1).
15. Coagulare l'MCA dal punto in cui si incrocia la vena cerebrale inferiore, fino al punto di biforcazione dell'arteria e poi lungo i rami caudali dell'MCA utilizzando un paio di pinze per diatermia fino a quando non è completamente occlusa. Utilizzare una pinza per diatermia angolata Jeweler con punte appuntite da 0,25 mm.
    1. Quando si occlude l'arteria, modificare il flusso salino se necessario per mantenere fresca quest'area, impedendo alle pinze coagulanti di aderire al vaso sanguigno. Quando è occluso, il vaso sanguigno appare nero e non dovrebbe essere presente alcun segno di flusso sanguigno; Il flusso sanguigno può essere visto nei vasi parzialmente occlusi.
    2. A questo punto tagliare l'MCA per confermare l'occlusione completa. Usando le forbici microvascolari, taglia sotto il punto in cui la vena cerebrale inferiore attraversa l'MCA.
    3. Coprire l'area esposta con una garza imbevuta di soluzione salina prima di procedere con il passaggio successivo.
16. Riporta il ratto in posizione supina e riapri la sutura legata in modo lasco sul collo per riesporre le arterie carotidi. Legare l'arteria carotide sullo stesso lato dell'MCA occluso (destro) in modo permanente legando un nodo nella sutura di seta attorno alla carotide, mentre l'arteria carotide sinistra viene occlusa transitoriamente utilizzando una clip arteriosa in acciaio inossidabile da 13 mm con una pressione di 125 g per 60 minuti. Sutura liberamente l'incisione nel collo durante questo periodo e posiziona sopra una garza sterile imbevuta di soluzione salina per prevenire la disidratazione.
    1. Si noti che il lato destro dell'animale sarà sul lato sinistro del chirurgo, data la posizione supina.

Risultati

Figura 1. Impostazione chirurgica del modello permanente di occlusione dell'arteria cerebrale media distale. L'attrezzatura utilizzata nella configurazione per la craniotomia di ratto è mostrata per l'emisfero destro e l'inserto, il posizionamento dell'aspiratore e il gocciolamento salino attorno al sito della craniectomia. Vengono inoltre mostrate le caratteristiche chiave del sistema vascolare; So...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Carprofene	Norbrook	Numero di videochiamata; 02000/4229	dare 0,25 mg/kg
Atropina solfato	AmTech	RXATRINJ-100
Tamponi imbevuti di alcol	UHS	20021
Crema di lidocaina (Emla)	AstraZeneca	12901	Applicare una goccia delle dimensioni di un pisello sul collo rasato e sulle regioni temporali
Sistema di coperte omeotermiche	Strumenti di Harvard	507222F
Pincipe	Strumenti di Fine Science	11019-12
Isoflurano	Abbott	B506
Suture di seta	Apparato di Harvard	723288
Sistema di cauterizzazione	Eschmann
0.25 mm Forcipe da caurteria da gioielliere	Eschmann	8330349
pinza di Dumont fine	Strumenti di Fine Science	11251-10
Sistema di gocciolamento salino azionato dal pollice
Sistema di aspirazione Vacusafe	INTEGRA BIOSCIENCES	158320
Macine in acciaio diamantate grossolane da 16 mm		K801 104 016
Trapano odontoiatrico portatile	NSK	NSKVMAXVRE (Manipolo NSKEX6B)
Forbici a molla Vannas	Strumenti di Fine Science	15000-03
Forbici microvascolari	Strumenti di precisione del mondo	501790
4-0 Suture Vicryl	Ethicon
Clip vascolare e applicatore
Microscopio operatorio	Zeiss
Sistema di anestesia compatto Isoflurane K/F Single Gas	Soluzioni VetTech
Lame per bisturi in acciaio al carbonio n. 10	Swann-Morton	201
aghi da 25 g	Terumo	NN-2525R
Siringhe (1 ml e 5 ml)	Terumo	SS+01T1 / SS*05SE1
Soluzione salina (cloruro di sodio 0,9%)	Fresenius Kabi	PL 08828/0178
Cotton fiocs	Johnson e Johnson	5.00021E+12	Sterilizzare prima dell'uso
Garza			Sterilizzare prima dell'uso