Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Prepara la siringa per l'iniezione
- Sciogliere la lisolecitina in una soluzione all'1% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; pH 7,4) e conservare a -20 °C in piccole aliquote (75 μl). Scongelare una fiala a temperatura ambiente (RT).
nota: Se la lisorecitina non è disciolta, sonicare il tubo in un pulitore a ultrasuoni (40 kHz) per circa 30 minuti per formare una soluzione uniforme.
- Maneggiare il capillare in vetro pre-estratto con estrema cura per evitare di danneggiare la delicata punta. Svitare il dado di una siringa per iniezione da 10 μl e avvitarlo sull'estremità piatta del capillare, seguito da due boccole, assicurandosi che le estremità di accoppiamento delle boccole siano allineate e che il capillare sia aderente alla ghiera conica (Figura 1). Sciacquare la siringa con alcol isopropilico e rimuovere lo stantuffo. Una volta asciutto, avvitare saldamente a mano il gruppo ago sulla siringa per l'iniezione.
- Collegare l'ago del mozzo metallico alla siringa di adescamento. Forare un disco di gomma con l'ago e farlo scorrere verso il basso fino alla base. Riempire la siringa di adescamento con lisolecitina. Premere delicatamente la siringa di adescamento fino a quando il liquido è visibile sulla punta dell'ago. Ciò garantisce che non vengano introdotte bolle d'aria nella siringa di iniezione.
- Inserire l'ago del mozzo metallico della siringa di adescamento nella siringa di iniezione. Facendo una tenuta salda con il disco di gomma, premere lentamente la siringa di adescamento fino a quando il capillare non riempie la punta con la soluzione. Rimuovere con cautela la siringa di adescamento e contemporaneamente premere per riempire il fusto della siringa di iniezione senza introdurre bolle d'aria. Inserire lo stantuffo nella siringa per l'iniezione e assicurarsi che la soluzione scorra dalla punta del capillare mentre lo stantuffo viene premuto delicatamente.
nota: Se sono visibili bolle d'aria nel capillare o nella siringa per l'iniezione, la preparazione della siringa deve essere ripetuta dall'inizio. Il fluido continuo nell'apparato di iniezione è fondamentale per garantire volumi di iniezione accurati.
- Collegare la siringa di iniezione completata al braccio di un micromanipolatore stereotassico. Questo apparecchio completato sarà in grado di iniettare 15-20 animali prima di dover essere ricaricato.
- Eliminare la lisolecitina rimanente dalla siringa di adescamento. Prelevare e premere più volte l'alcol isopropilico e staccare l'ago del mozzo metallico. Attendere diverse ore affinché l'alcol isopropilico rimanente nella siringa di adescamento evapori prima di riempirlo nuovamente.
2. Prepara l'animale per la procedura chirurgica
NOTA: Questa procedura è descritta per topi femmina C57BL/6 di età compresa tra 8 e 10 settimane.
- Anestetizzare l'animale con un'iniezione intraperitoneale di ketamina (200 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) o secondo le normative istituzionali sulla cura degli animali. Pianificare che l'animale sia sotto anestesia per circa 1 ora se si utilizza l'anestesia iniettabile.
- Verificare che l'animale sia profondamente anestetizzato pizzicando con decisione il piede. Un animale adeguatamente anestetizzato non risponderà al pizzico.
- Utilizzando le tosatrici, radere un'area di 2-3 cm2 sul lato dorsale dell'animale, vicino alle orecchie. Fare attenzione a non danneggiare le orecchie.
- Pulisci l'area con etanolo al 70% applicato su una garza. Assicurarsi che tutti i peli tagliati siano stati rimossi dall'area. Disinfettare l'area con iodio.
- Applicare vaselina sugli occhi per evitare che si secchi durante la procedura.
- Tenere l'animale in una camera di recupero riscaldata fino al momento di iniziare la procedura.
3. Esegui la procedura chirurgica
NOTA: Garantire un'adeguata tecnica asettica per tutte le fasi della procedura. Ciò include l'uso corretto di guanti, retine per capelli, maschere e tende. Tutti gli strumenti devono essere sterilizzati prima di entrare in contatto con l'animale.
- Sposta l'animale su una cornice stereotassica, con la schiena rivolta verso l'alto, sollevato nella sezione centrale da tovaglioli di carta piegati per esagerare la curvatura della colonna vertebrale. Fissare le braccia e la coda con del nastro chirurgico e fissare la testa con una pinza dentata. Per questa procedura non sono necessarie barre auricolari stabilizzatrici.
- Con un bisturi praticare un'incisione della linea mediana di 3 cm, iniziando appena sotto le orecchie e tagliando in direzione caudale.
- Individua il divario tra le due grandi strutture adipose e usa una pinza sottile in ciascuna mano per separarle. Divaricatori sparsi per aprire il campo chirurgico.
- Sotto un microscopio operatorio, individuare il processo di crescita prominente della vertebra toracica 2 (T2) (NOTA: questa caratteristica è caratteristica del ceppo di topo C57BL/6). Eseguire una dissezione smussata con forbici a molla chiuse attraverso la muscolatura sovrapposta per visualizzare meglio T2. Usando il forcipe, tastare le superfici dure della vertebra toracica 3 (T3) e della vertebra toracica 4 (T4) per confermare la corretta posizione anatomica.
- Utilizzando le forbici a molla, eseguire tagli laterali poco profondi (2-3 mm di profondità) del tessuto connettivo tra T3 e T4. A causa della distanza naturale tra le vertebre nella parte toracica superiore della colonna vertebrale del topo, una laminectomia non è necessaria per rivelare il midollo spinale. Tieni presente che un taglio troppo profondo forerà e danneggerà il cordone.
nota: Un piccolo grado di sanguinamento è comune durante questa fase. In tal caso, tenere una lancia di spugna nell'area fino a quando l'emorragia non si attenua (30-60 sec).
- Visualizza il midollo spinale. Sarà coperto da uno spesso strato di dura madre visibile se questo strato meningeo non è ancora stato tagliato durante l'esposizione del cordone. Un vaso sanguigno prominente corre caudale/rostrale attraverso la linea mediana approssimativa del midollo spinale.
nota: Questo sistema vascolare non deve essere utilizzato come punto di riferimento per la linea mediana. Invece, un'illuminazione adeguata dovrebbe rivelare i confini di materia grigio-bianca che fiancheggiano la colonna dorsale, che dovrebbe essere utilizzata per stimare la linea mediana.
- Se la dura madre rimane intatta, fare dei raschietti laterali delicati con un ago di metallo da 32 G fino a quando non si schiarisce. L'obiettivo è quello di rimuovere la dura madre senza tagliare le restanti meningi sottostanti, che non sono così spesse e più difficili da vedere.
nota: Il rilascio di liquido cerebrospinale indica una violazione dell'aracnoide e, sebbene ciò possa verificarsi senza danni meccanici al tessuto, il liquido cerebrospinale accumulato deve essere rimosso con una lancia di spugna per visualizzare meglio la superficie del midollo.
- Spostare la siringa per l'iniezione in posizione e abbassarla lentamente fino a quando la punta del capillare tocca appena il midollo spinale immediatamente lateralmente di entrambi i lati della linea mediana. Bloccare il braccio in posizione.
- Utilizzare le misurazioni graduali del braccio stereotassico in direzione Z per effettuare una misurazione della posizione di base. Da questa lettura, sottrarre 1,3 mm. Utilizzare un movimento rapido e superficiale verso il basso per perforare il tessuto e abbassare con cautela il capillare fino a raggiungere la nuova misurazione. Opzionale: se lo si desidera, le lesioni nella colonna dorsale possono essere prodotte con lo stesso movimento di perforazione sulla linea mediana e una profondità di 0,3 mm.
nota: Questi valori sono specifici per l'iniezione tra T3 e T4. Se si sceglie di eseguire l'iniezione in qualsiasi altra posizione del midollo spinale, questi valori devono essere derivati da qualsiasi atlante cerebrale di topo disponibile.
- Utilizzare il micromanipolatore per deprimere la lisolecitina nella sostanza bianca ventrale del midollo spinale. Effettuare una rotazione del micromanipolatore ogni 5 secondi per 2 minuti, ottenendo un volume finale di 0,5 μl. Lasciare il capillare in posizione per altri 2 minuti per evitare il riflusso della soluzione, quindi rimuovere con cura il capillare.
- Legare una singola sutura nel muscolo/tessuto adiposo che si sovrappone alla colonna vertebrale. Utilizzare una sutura ininterrotta per chiudere la pelle. Applicare più iodio nel sito di incisione.
- Metti l'animale in una camera di recupero riscaldata fino a quando non si riprende, quindi rimettilo nella sua gabbia. Applicare analgesici dopo l'intervento secondo le normative istituzionali sulla cura degli animali. Di solito non sono necessarie ulteriori cure post-operatorie poiché gli animali sono completamente deambulanti e in grado di nutrirsi e bere da soli non appena si riprendono dall'anestesia.
- Ripetere la procedura per gli animali rimanenti.
nota: Con competenza, l'operazione può essere completata in 10-15 minuti per animale, in particolare con l'aiuto di una seconda persona che lega i punti di sutura. Lo stesso capillare in vetro può essere utilizzato per circa 15-20 interventi chirurgici prima che la punta diventi smussata e debba essere sostituita. Gli interventi chirurgici di controllo possono essere eseguiti in modo identico a come descritto, con un'iniezione di PBS nel midollo spinale invece della lisolecitina. Si sconsiglia di pulire i capillari per un uso futuro.
