Induzione di una lesione neuronale mirata utilizzando un laser ad alta potenza in una larva di Drosophila

Abstract

Fonte: Li, D., Li, F., et al. Un modello di lesione in vivo di Drosophila per lo studio della neurorigenerazione nel sistema nervoso periferico e centrale. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video mostra un metodo per indurre un danno neuronale mirato nelle larve di Drosophila utilizzando un laser ad alta potenza. Dopo aver posizionato la larva al microscopio, un laser a bassa potenza esegue la scansione dei neuroni fluorescenti, quindi la potenza del laser viene aumentata per indurre un danno localizzato. La lesione è confermata da un aumento della fluorescenza e da un cratere nel sito della lesione.

Protocollo

1. Danno a due fotoni e imaging confocale

1. Configurazione del microscopio
   NOTA: Per questo esperimento è stato utilizzato un microscopio a scansione laser confocale con un laser a due fotoni, ma saranno sufficienti anche altri sistemi con una configurazione equivalente. Il laser a due fotoni (930 nm) è stato utilizzato per l'erogazione di lesioni e un laser ad argon (488 nm) è stato utilizzato per l'imaging confocale della GFP.
   1. All'inizio di ogni sessione, accendere il laser a due fotoni e/o il/i laser/i confocale/i e il microscopio. Quindi, apri il software di imaging.
   2. Per le lesioni da due fotoni, impostare i seguenti parametri per l'imaging GFP con il laser a due fotoni a 930 nm (1.950 mW).
      1. Selezionare la modalità di scansione lineare. Apri completamente il foro stenopeico. Aumentare l'intensità del laser a ~20% (390 mW).
      2. Selezionare 512 x 512 come scansione del fotogramma. Utilizzare la massima velocità di scansione (in genere con il tempo di permanenza dei pixel a 0,77 μs). Assicurarsi che il numero medio sia 1 e che la profondità di bit sia 8 bit.
      3. Impostate il guadagno su ~750 e l'offset su 0.
      4. Salva questo protocollo sperimentale preimpostato come 2P GFP 930 Ablation, consentendo un facile riutilizzo in esperimenti futuri.
   3. Per l'imaging confocale, impostare i seguenti parametri per l'imaging GFP con il laser ad argon a 488 nm:
      1. Seleziona la scheda Acquisizione e poi Z-stack.
      2. In "Laser", accendi il laser Argon a 488 nm.
      3. Vai su Canali, seleziona il laser da 488 mm e aumenta la potenza del laser al 5-10%. Per il foro stenopeico, utilizzare l'unità 1-2 airy (AU). Regola il guadagno su 650.
      4. In Modalità di acquisizione, selezionare 1024 x 1024 come scansione dei fotogrammi, utilizzare la velocità di scansione massima, un numero medio di 2 e una profondità di bit di 8 bit.
      5. Salva questo protocollo sperimentale preimpostato come GFP(green fluorescent protein) Imaging.
2. Anestesia larvale con etere etilico e montaggio
   1. In una cappa aspirante, posizionare una capsula di vetro da 60 mm in una capsula di Petri di plastica da 15 cm. Piegare e stendere un pezzo di carta velina sul fondo della pirofila di vetro, quindi posizionare un piatto di agar per succo d'uva sul fazzoletto. Aggiungere l'etere etilico nel piatto di vetro, fino al punto in cui la carta velina è imbevuta e rimane uno strato di etere liquido nel piatto. Tenere sempre il coperchio.
   2. Preparare un vetrino con una goccia di olio alocarbonico 27 al centro. Aggiungere 4 punti di grasso sottovuoto sui quattro angoli del vetrino, per sostenere successivamente il vetrino.
   3. Usa una pinza per raccogliere una larva pulita e posizionarla sulla piastra di agar nel piatto di vetro da 60 mm. Copri il piatto di vetro con il suo coperchio e attendi che la larva smetta di muoversi. Per lesioni/imaging PNS, estrarre la larva non appena la coda smette di contrarsi. Per il SNC, attendere che l'intera larva diventi immobile, in particolare i segmenti della testa.
      NOTA: La tempistica dell'esposizione all'etere è fondamentale. Vedi Discussione.
   4. Raccogli con cura la larva anestetizzata e posizionala a testa in su nella goccia di olio di alocarburi sul vetrino. Aggiungi un vetrino coprioggetti sopra il vetrino. Esercitare una leggera pressione per spingere verso il basso il vetrino coprioggetti, fino a toccare la larva (Figura 1A).
   5. Regola la posizione della larva spingendo delicatamente il vetrino coprioggetti verso sinistra o verso destra per far rotolare la larva, in modo che il neurone/assone/dendrite di interesse si trovi in alto e più vicino alla lente del microscopio.
   6. Per la lesione del PNS, montare la larva con il lato dorsale rivolto verso l'alto, in modo che entrambe le trachee siano visibili. Quindi ruotare la larva di ~30 gradi a sinistra per ferire gli assoni dei neuroni di classe III da (Figura 1B e 1C), di 90 gradi per ferire gli assoni dei neuroni di classe IV (Figura 1B e 1E), o ~30 gradi per ferire i dendriti dei neuroni di classe IV da.
   7. Per le lesioni al SNC, posizionare la larva in modo che sia perfettamente ventrale verso l'alto, in modo che la regione di interesse sia più vicina alla lente del microscopio nel piano z.
3. Lesione da laser a due fotoni
   1. Posizionare il vetrino con la larva sotto il microscopio e fissarlo in posizione con il supporto del vetrino sul tavolino. Usa l'obiettivo 10X (0,3 NA) per trovare la larva.
   2. Aggiungere 1 goccia di olio per obiettivi sul vetrino coprioggetti, passare all'obiettivo 40X (1,3 NA) e regolare la messa a fuoco.
   3. Passa alla modalità di scansione e riutilizza il protocollo sperimentale 2P GFP 930 Ablation. Assicurati che il foro stenopeico sia completamente aperto.
      NOTA: La configurazione deve essere ottimizzata in base ai singoli sistemi.
   4. Avvia la modalità Live per localizzare la regione di interesse (ROI) e ottimizza le impostazioni per ottenere una buona qualità dell'immagine con lo zoom appropriato.
      NOTA: Lo scopo di questo passaggio è trovare il neurone/assone/dendrite da danneggiare, piuttosto che prendere l'immagine della migliore qualità. Pertanto, utilizzare le impostazioni minime sufficienti per visualizzare l'area target, al fine di evitare la sovraesposizione o il fotobleaching.
   5. Interrompi Live scan, in modo che il pulsante Ritaglia diventi disponibile. Lascia che l'immagine fissa funga da tabella di marcia. Seleziona la funzione Ritaglia e regola la finestra di scansione per concentrarti sul bersaglio da ferire.
   6. Ridurre il ROI in modo che corrisponda alla dimensione del potenziale sito di lesione. Ad esempio, basta coprire la larghezza di un assone o di un dendrite, per garantire la precisione della lesione e ridurre i danni ai tessuti vicini. Se lo si desidera, ingrandire il ROI prima del ritaglio, consentendo lesioni più precise.
   7. Aprire una nuova finestra di imaging. Ridurre la velocità di scansione e aumentare l'intensità del laser. Determina l'aumento dell'intensità del laser in base al segnale di fluorescenza tissutale scansionato in modalità Live .
   8. In genere, impostare l'intensità del laser a due fotoni a partire dal 25% per la lesione PNS e dal 50-100% per la lesione VNC. Per la lesione dell'assone PNS, assicurarsi che l'intensità del laser sia ~480 mW e che il tempo di permanenza dei pixel sia di 8,19 μs. Per la lesione dell'assone VNC, assicurarsi che l'intensità del laser e il tempo di permanenza dei pixel siano solitamente 965-1930 mW e 8,19-32,77 μs, rispettivamente.
   9. Avvia Scansione continua . Lascia il cursore al passo con il mouse sul pulsante Continuo . Tenere d'occhio l'immagine e interrompere la scansione non appena si osserva un drastico aumento della fluorescenza.
      NOTA: La comparsa del picco di fluorescenza è dovuta all'autofluorescenza nel sito della lesione.
   10. Torna alla modalità Live riutilizzando le impostazioni. Trova l'area di interesse che è stata appena presa di mira regolando lo stato attivo.
       NOTA: Una buona indicazione di lesioni riuscite è la comparsa di un piccolo cratere, di una struttura ad anello, o di detriti localizzati proprio nel sito della lesione.
   11. Passa al neurone successivo e ripeti dal passaggio 1.3.5 per ferire più neuroni in un singolo animale. Oppure ripetere il passaggio 3.3.5 aumentando gradualmente la potenza e/o riducendo la velocità di scansione se la lesione iniziale era insufficiente.
       NOTA: Nel caso in cui la potenza del laser sia troppo alta, un'ampia area danneggiata sarà visibile nell'immagine di scansione dal vivo post-infortunio. Troppe lesioni possono causare la morte della larva.
   12. Recuperare la larva rimuovendo con cura il vetrino coprioggetti e trasferendo la larva ferita su una nuova piastra con pasta di lievito. Scavare diverse grotte sulla piastra di agar con una pinza; In alternativa, crea un'isola di agar nella piastra invece di utilizzare l'intera piastra, per ridurre la possibilità che la larva strisci fuori dalla piastra.
   13. Mettere la piastra in una capsula di Petri da 60 mm con fazzoletto umido (imbevuto di soluzione di acido propionico allo 0,5%) e coltura a temperatura ambiente o 25°C.
       NOTA: La larva rimarrà allo stadio larvale per circa un giorno in più a temperatura ambiente (22°C) rispetto a 25°C.

Risultati

Figura 1: La rigenerazione dell'assone del neurone Da nella periferia mostra una specificità di classe. (A e B) Disegno schematico che mostra la posizione delle larve. (C) Disegno schematico di neuroni da di classe III. (D) Gli assoni dei neuroni da ddaF di classe III, marcati con 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80/+, non riescono a ricrescere. (E) Disegno schematico di neuroni da di classe IV. ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Etere etilico, reattivo ACS, anidro	Acros Organics	AC615080010
Olio alocarburo 27	Genesee Scientific	59-133
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 20x concentrato, pH 7,5, fornitore # E703-1L	VWR	97062-948
Agar in polvere, Alfa Aesar, 500GM	VWR	AAA10752-36
Succo d'uva	Di Welch
Etanolo 95% (Alcool reattivo 95%)	VWR	64-17-5
Acido acetico	Sigma-Aldrich	A6283
Acido propionico	J.T.Baker	U33007
Copri occhiali: Rettangolo	Fisher Scientific	12-544-D	50 mm X 22 mm
Microscopio a scansione laser Zeiss LSM 880	Zeiss
Zen software	Zeiss
Camaleonte Ultra II	Coerente