1. Preparazione dei terreni e dei reagenti
- Scongelare il rivestimento della matrice della membrana basale per piastre di coltura a 4 °C (non lasciare che la matrice della membrana basale si riscaldi, altrimenti si solidifiche). Preparare aliquote da 1 ml e conservarle a -20 °C o -70 °C.
- Ricostituire il fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF) in soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) a 10 μg/mL e produrre aliquote da 10 μL. Conservarli a 4 °C.
- A un nuovo flacone da 500 ml di DMEM/F12 con glutammina, non aperto, aggiungere B27 (10 ml), N2 (5 ml) e penicillina-streptomicina (5 ml). Porre 50 mL di questo terreno di coltura per cellule staminali neurali (NSC) in una provetta conica e aggiungere 10 μL di 10 μg/μL (2 μg/mL finale) di bFGF. Conservare il terreno NSC (+) bFGF a 4 °C.
- Per creare (-) terreni bFGF, utilizzare la stessa ricetta descritta nel passaggio 1.3 ma non aggiungere bFGF. Questi terreni saranno utilizzati per differenziare le NSC in neuroni e per mantenere le colture neuronali dopo la differenziazione.
2. Costrutti lentivirali
NOTA: Prima di iniziare a lavorare con i costrutti lentivirali, assicurarsi che il laboratorio sia stato approvato per l'uso di agenti di livello di biosicurezza 2 (BSL-2). Inoltre, quando si lavora con vettori lentivirali, è necessario utilizzare cappucci di coltura BSL-2, dispositivi di protezione individuale (DPI) e metodi di smaltimento.
- Ottieni costrutti tau impacchettati in lentivirus da una fonte preferita.
3. Coltura di cellule staminali neurali umane
NOTA: Le NSC sono tipicamente seminate a 100.000-150.000 cellule/cm2 e la maggior parte delle NSC disponibili in commercio sono vendute come 1 x 106 cellule/fiala. Questo protocollo è stato ottimizzato per piastre per colture cellulari da 10 cm (anche se possono essere utilizzate piastre di altre dimensioni); pertanto, se vengono utilizzate NSC disponibili in commercio, potrebbe essere necessario espanderle prima coltivandole in piastre a sei pozzetti per ottenere un numero sufficiente di cellule per seminare piastre da 10 cm. In alternativa, questo protocollo può essere adattato a una varietà di dimensioni di piastre per colture cellulari.
- Per la preparazione di piastre per colture cellulari, rimuovere un'aliquota del rivestimento della matrice della membrana del basamento congelata per piastre per colture cellulari e lasciarla scongelare a 4 °C (le aliquote possono essere poste a 4 °C durante la notte il giorno prima della semina delle cellule). Aggiungere 385 μL di rivestimento della matrice della membrana basale a 5 mL di terreno DMEM/F12 + penicillina-streptomicina.
NOTA: 5 mL di terreno DMEM/F12 + penicillina-streptomicina sono sufficienti per rivestire un singolo piatto da 10 cm (1 mL di questa soluzione di rivestimento della matrice a membrana basale è sufficiente per rivestire un pozzetto di un piatto a sei pozzetti). In alternativa, se le cellule devono essere fissate e immunocolorate, o colorate per la tioflavina, colture di cellule su vetrini coprioggetti in piastre di coltura a 24 pozzetti.
- Mantenere freddi i terreni e il rivestimento della matrice prima e durante l'aggiunta ai piatti di coltura. Aggiungere il rivestimento della matrice della membrana del basamento alle piastre di coltura e posizionare le piastre in un'incubatrice (a 37 °C) per 1 ora. Per un rivestimento ottimale, non incubare la matrice della membrana basale per più o meno di 1 ora. Dopo 1 ora, aspirare il rivestimento della matrice della membrana basale dalle piastre di coltura cellulare. Assicurati che ciò coincida con il fatto che le NSC siano pronte per essere impiattate.
NOTA: Se le celle non vengono scongelate dalle scorte congelate, saltare il passaggio 3.2 e continuare con il passaggio 3.3.
- Se le cellule vengono scongelate da scorte di NSC congelate, prendere una fiala di cellule congelate e scaldarla in un bagno d'acqua riscaldato a 37 °C muovendo la fiala avanti e indietro nell'acqua. Una volta scongelata, spruzzare la fiala con etanolo al 70% e metterla in una cappa di coltura cellulare. Trasferire le cellule in ~10 mL di DMEM/F12 + terreno di coltura penicillina-streptomicina e centrifugare la provetta a temperatura ambiente a 1.000 x g per 5 minuti. Aspirare il terreno e risospendere le cellule nel terreno NSC.
- Diluire le cellule nei terreni NSC per ottenere la densità di semina appropriata per il recipiente di coltura cellulare che si sta utilizzando.
NOTA: Ad esempio, se le NSC vengono piastrate su una piastra a sei pozzetti, un pozzetto su una piastra di coltura a sei pozzetti ha una superficie di 9 cm2, sono necessarie da 900.000 a 1.350.000 cellule per seminare. Quindi, una fiala contenente 1.000.000 di cellule può essere risospesa in 2 mL di terreno e aggiunta a un singolo pozzetto di un piatto a sei pozzetti.
- Aggiungere un numero sufficiente di cellule sospese in terreni NSC per seminare le piastre di coltura rivestite con matrice di membrana basale (100.000 cellule/cm2) e cambiare il terreno a giorni alterni (se si utilizza un materiale congelato, cambiare il terreno il giorno dopo la placcatura e successivamente a giorni alterni). Far crescere le cellule fino a quando non sono confluenti al 75%-80%.
NOTA: Le celle probabilmente raggiungeranno il 75%-80% di confluenza poco dopo la placcatura, ma questo potrebbe richiedere più tempo se vengono utilizzate scorte congelate.
- Una volta che le NSC sono confluenti al 75%-80%, iniziare la differenziazione neuronale rimuovendo il terreno NSC (+) bFGF e sostituendolo con NSC (-) terreno bFGF. Coltivare le cellule in questo terreno (sostituendo il terreno a giorni alterni) per almeno 4 settimane.
NOTA: Le cellule continueranno a dividersi per alcuni giorni dopo il ritiro di bFGF; Pertanto, le cellule possono raggiungere il 90-100% di confluenza.
- Dopo la coltura per 4 settimane, le cellule avranno raggiunto un destino neuronale e saranno pronte per il trattamento del lentivirus.
4. Trasduzione e mantenimento delle colture neuronali
- Per trasdurre i neuroni con lentivirus, utilizzare un titolo di 3,4 x 105 unità trasducibili/cellula (un piatto confluente al 100% di 10 cm conterrà ~10 milioni di neuroni). Diluire le unità trasducibili alla concentrazione necessaria nei terreni di coltura cellulare e aggiungerle alle cellule (utilizzare il volume normale di terreno per la piastra di coltura cellulare). Due giorni dopo l'aggiunta del lentivirus, lavare le cellule 1 volta con terreno bFGF fresco (-) (senza lentivirus) e continuare la coltura in terreno bFGF (-) come al solito.
- Per il trattamento post-lentivirale, alimentare i neuroni trasdotti cambiando il terreno di coltura cellulare ([-] terreno bFGF) a giorni alterni. Mantenere le cellule per ~8 settimane dopo la trasduzione. Visualizzare regolarmente le cellule al microscopio ottico per garantirne la vitalità.
NOTA: La scarsità o le rotture dendritiche sono segni che le cellule non sono più vitali.
