Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparativi
- Modificare un catetere venoso periferico da 16 G per l'intubazione. Per modificare, accorciare l'ago di 1 cm e piegare il restante distale di 1 cm di 30° verso la valvola di iniezione. Rimuovere le alette del catetere (uso multiplo).
- Per realizzare una sonda di pressione intracranica o ICP, tagliare un pezzo di tubo di polietilene da 20 mm (diametro interno (ID): 0,58 mm, diametro esterno (OD): 0,96 mm) e bruciare un'estremità per creare una piastra circolare, mantenendo un lume aperto. Aggirare il tubo in polietilene con 1 mm di tubo in silicone (ID: 1,0 mm, OD: 3,0 mm) prima di collegare 10 mm di tubo in silicone (ID: 0,76 mm, OD: 2,4 mm) all'estremità del tubo in polietilene.
- Accendere il laptop e aprire il software di acquisizione dati. Calibrare i trasduttori di pressione sanguigna (BP) e di pressione intracerebrale (ICP) e il Laser-Doppler secondo le istruzioni del produttore.
- Preparare l'apparecchio per l'analizzatore di gas ematici.
cautela: Assicurati che ci sia abbastanza isoflurano nel vaporizzatore.
- Attiva l'O2 e il flusso d'aria atmosferica. Impostare il flusso di O2 al 30% e l'aria atmosferica al 70%.
- Posizionare il termoforo e impostare la temperatura a 37 °C.
2. Anestesia
- Posizionare il ratto nella camera di anestesia con un flusso del 30% di O2 e del 70% di aria atmosferica. Somministrare il 5% di gas isoflurano nella camera. Un'anestesia adeguata richiederà circa 4 minuti. Controlla attentamente la respirazione.
- Una volta anestetizzato, posizionare il ratto in posizione supina su una piastra pesante aggirata da un elastico. Posiziona i denti anteriori del ratto sotto l'elastico.
- Estrarre con cura la lingua con una pinza curva. Pulisci la laringe con una punta di cotone. Posiziona una luce esterna nella linea mediana della gola per visualizzare le corde vocali.
- Intubare durante l'inspirazione utilizzando il catetere venoso periferico modificato da 16 G. Una volta inserito correttamente, rimuovere lo stiletto. Collegare il catetere al ventilatore.
nota: Il corretto posizionamento del tubo è confermato da movimenti del torace sincronizzati con la frequenza respiratoria. Se si notano movimenti dell'addome, estubare e reintrodurre il ratto nella campana dell'anestesia. Non ripetere la procedura più di tre volte a causa del rischio di danneggiare le vie aeree.
- Quando intubato, mantenere l'animale in respirazione artificiale con il 30% di O2 e il 70% di aria atmosferica. Mantenere l'anestesia all'1,5%-3% di isoflurano. Regolare l'isoflurano per mantenere la pressione sanguigna tra 80-100 mmHg.
- Mantenere il volume inspiratorio del respiratore a 3 ml e la frequenza a 40-45 inspirazioni/min. Regolare il volume inspiratorio in base all'emogasanalisi.
- Fai un punto attraverso il tessuto molle interno della guancia con una sutura 2-0. Legare la sutura attorno al tubo di iniezione e alla valvola di iniezione del catetere venoso periferico per fissare il catetere.
- Spostare il ratto nel campo operatorio e posizionarlo in posizione supina con la coda rivolta verso il chirurgo.
- Applicare il gel contorno occhi quando necessario per contrastare la secchezza oculare.
- Eseguire un pizzicamento delle dita dei piedi per confermare un'adeguata profondità di anestesia. Valutare e mantenere la profondità dell'anestesia durante l'intervento chirurgico.
3. Catetere di coda
- Disinfettare i 3-4 cm prossimali della coda con lo 0,5% di clorexidina etanolo.
nota: D'ora in poi, utilizzare il microscopio operatorio a discrezione del chirurgo.
- Praticare un'incisione cutanea di 15-20 mm nell'estremità prossimale della coda sul lato ventrale. Fare attenzione a non incidere l'arteria.
- Staccare la pelle dal tessuto connettivo sottostante utilizzando una pinza curva.
- Penetrare con cautela nella fascia esponendo l'arteria.
- Rilasciare con cautela l'arteria caudale dal tessuto sottostante utilizzando una pinza curva.
- Infilare tre fili di seta nera sotto il recipiente. Posizionare un filo il più distalmente possibile e legare strettamente un nodo chirurgico attorno all'arteria. Tenere le estremità libere del filo con un emostato.
- Legare i due fili rimanenti attorno all'arteria.
- Spingere il filo prossimale il più vicino possibile. Applicare un emostatico per tenere le estremità del filo prossimale. Tirare l'emostatico leggermente, ma quanto basta per limitare e bloccare il flusso sanguigno. Posizionare l'emostatico sull'addome.
- Tagliare la punta del catetere con un angolo di 45°. Tagliare la punta acuminata per evitare la penetrazione della parete arteriosa.
- Utilizzando una forbice Vannas, praticare un'incisione arteriosa di 1/3 del diametro dell'arteria con un angolo di 30°, a 3-5 mm dal nodo distale.
- Inserire il catetere nell'arteria utilizzando due pinze diritte. Utilizzare una pinza per tenere il catetere e l'altra per tirare con cautela l'arteria sopra il catetere.
- Inserire il catetere nel vaso fino al nodo prossimale e allentare il nodo dall'emostato. Visualizzare il flusso sanguigno nel catetere. Fissare il filo centrale senza stringere al catetere.
- Continuare l'inserimento e, se possibile, appena oltre il punto in cui l'arteria è nuovamente coperta dalla fascia.
- Controllare il posizionamento del catetere e l'eventuale fuoriuscita mediante lavaggio con soluzione fisiologica.
- Fissare i due fili prossimali utilizzando nodi chirurgici.
nota: La misurazione della pressione sanguigna deve essere pulsatile; In caso contrario, il catetere non è posizionato correttamente.
- Fissare il catetere alla fine dell'incisione legando un nodo chirurgico utilizzando il filo distale.
- Cucire l'incisione cutanea senza stringere insieme con due suture monofilamento 4-0 non riassorbibili. Fare attenzione a non penetrare il catetere.
nota: Durante l'intervento chirurgico sii consapevole dell'ampiezza della pulsazione. Se questo è basso, sciacquare il catetere con soluzione fisiologica.
- Allentare il catetere arterioso dal trasduttore di pressione per consentire il flusso sanguigno per il prelievo di gas nel sangue. Posizionare un tubo microcapillare all'estremità del catetere. Lascia che il sangue fluisca nel tubo. Ricollegare il catetere al trasduttore dopo il prelievo di sangue e lavare il catetere.
- Inserire il tubo capillare nell'analizzatore di gas ematici. Misurare il pH, il pCO2 e il pO2 e annotarli
NOTA: A seconda dei valori di gas nel sangue e pressione sanguigna, modificare la velocità di ventilazione. Se la pressione arteriosa media (MAP) è troppo bassa, provare ad abbassare la portata dell'isoflurano. Testare i riflessi per garantire la corretta profondità dell'anestesia.
4. Sonda ICP
- Posiziona il ratto nel fotogramma stereotassico. È importante posizionare il ratto simmetricamente.
- Posizionare un cuscino cilindrico sotto il telaio stereotassico per creare la flessione anteriore del collo.
- Radi il cuoio capelluto, il collo e l'area dietro le orecchie del ratto. Rimuovere i peli superflui.
- Disinfettare l'area con lo 0,5% di clorexidina etanolo.
- Anestetizzare localmente con 0,7 mL di 10 mg/5 μg/mL di lidocaina con adrenalina, inserire l'ago all'estremità caudale del cranio nella linea mediana. Iniettare nella muscolatura del collo con 0,3-0,4 mL. Iniettare il resto per via sottocutanea intorno e anteriormente al bregma.
- Praticare un'incisione cutanea dalla puntura dell'ago ~8 mm caudalmente nella linea mediana.
- Sezionare tutti i muscoli senza mezzi termini a strati per identificare la membrana atlanto-occipitale (triangolo color marmo caudalmente al cranio nella linea mediana).
- Utilizzare il divaricatore Alm per frenare la muscolatura del collo. Posizionare il divaricatore a punta caudalmente, se necessario.
- Controllare se la sonda ICP sterile è collegata al trasduttore ICP. Lavare la sonda ICP con soluzione fisiologica. Assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria nella sonda ICP.
- Incidere la membrana atlanto-occipitale con un ago da 23 G. Praticare un foro per far passare la sonda ICP attraverso la membrana.
- Far passare delicatamente la sonda attraverso la membrana atlanto-occipitale. Tirare leggermente la sonda e assicurarsi che mostri una curva pulsante compresa tra 0 e 5 mmHg. In caso contrario, rimuovere la sonda, controllare il collegamento al trasduttore e confermare il flusso attraverso il lume.
- Applicare due gocce di colla per tessuti. Spostare il tubo in silicone da 1 mm in avanti verso la membrana e applicare colla aggiuntiva per ridurre al minimo il rischio di spostamento della sonda ICP.
- Rimuovere il/i divaricatore/i.
- Realizzare una sutura a materasso orizzontale all'estremità cefalica dell'incisione e una semplice sutura interrotta all'estremità caudale utilizzando una sutura monofilamento 4-0 non riassorbibile.
5. Posizionamento dell'ago e della sonda Laser-Doppler
- Praticare un'incisione nella linea mediana appena anteriormente agli occhi, 15 mm caudalmente.
- Rimuovere il tessuto connettivo e i muscoli con una pinza. Utilizzare l'estremità di un batuffolo di cotone sterile come rougine che consente di identificare la bregma e le suture coronali.
- Posizionare il divaricatore Alm.
- Posizionare un ago spinale da 25 G nel telaio stereotassico. Posiziona l'ago esattamente sulla bregma e annota la posizione.
nota: Posizionare l'articolazione della linea mediana del telaio stereotassico a 30° verso l'animale sul piano verticale.
- Rimuovere l'ago dal bregma, spostare il telaio di 65 mm anteriormente, quindi sostituire l'ago nella linea mediana per contrassegnare il sito di perforazione.
- Forare fino a quando la dura madre non viene identificata sotto l'osso. Rimuovere delicatamente i frammenti ossei utilizzando una pinza dritta e riempire la cavità con cera ossea.
- Praticare un altro foro di 3-4 mm lateralmente a destra della bregma e appena anteriormente alla sutura coronale per il Laser-Doppler. Non è necessario perforare completamente l'osso. Fare attenzione a non penetrare nella dura madre.
- Cerca i vasi in cui il laser-doppler può misurare il flusso sanguigno. Posizionare il laser-doppler e controllare i valori. È richiesto un valore minimo di 100 UF. Rimuovere il microscopio (luce artificiale).
- Se i valori sono ancora accettabili, aggiungere una goccia di colla per fissare la sonda.
- Ricontrollare per confermare se il valore è superiore a 80 FU. Se il valore è inferiore a 80 FU, rimuovere e riposizionare la sonda per raggiungere un valore superiore a 80 FU.
NOTA: Il valore, FU, è un'unità arbitraria che mostra il flusso sanguigno cerebrale (CBF).
6. Induzione di emorragia subaracnoidea (SAH)
- Inserire delicatamente l'ago attraverso il cranio nella linea mediana tra gli emisferi fino a quando non si avverte la resistenza della base del cranio. Ritrarre l'ago di 1 mm per garantire il corretto posizionamento appena anteriormente al chiasma ottico.
- Ruotare l'ago di 90° in senso orario in modo che la punta dell'ago sia rivolta verso destra per garantire il risultato più omogeneo durante l'iniezione del sangue. Rimuovere lo stiletto (Figura 1).
- Equilibrare per 15 minuti e regolare il livello di anestesia per ottenere una pressione arteriosa media nell'intervallo 80-100 mmHg.
- Eseguire un'emogasanalisi. Regolare il livello di anestesia di conseguenza.
- Prelevare 500 μL di sangue dal catetere caudale utilizzando una siringa da 1 ml con un ago smussato da 23 G.
- Riempire lo spazio morto della camera dell'ago spinale con sangue per evitare l'iniezione di aria. Rimuovere l'ago da 23 G dalla siringa piena di sangue e verificare che la siringa contenga 300 μL di sangue.
- Collegare la siringa all'ago spinale. Afferrare saldamente e iniettare il sangue manualmente per superare la MAP.
- Osserva un forte aumento dell'ICP e un forte calo del CBF sul laptop.
nota: Il CBF deve essere del 50% o inferiore rispetto al punteggio basale per almeno 5 minuti affinché l'intervento chirurgico abbia successo, vedere la Figura 2. I ratti fittizi non subiscono i passaggi 6.1-6.7, omettendo così l'introduzione dell'ago spinale nel cervello, riducendo al minimo la possibile emorragia spontanea e il danno cerebrale iatrogeno.
