Misurazione di più parametri mitocondriali nei neuroni mediante citometria a flusso

Abstract

Fonte: Liang, K. X., et al. Analisi citometrica a flusso di più parametri mitocondriali in cellule staminali pluripotenti indotte umane e loro derivati neurali e gliali. J. Vis. Exp. (2021)

Questo video mostra la marcatura delle cellule neuronali con anticorpi per i complessi della catena respiratoria mitocondriale, la proteina associata al DNA mitocondriale e la proteina della membrana esterna mitocondriale, seguita da citometria a flusso per quantificarne i livelli.

Protocol

1. Misurazione della citometria a flusso delle subunità del complesso MRC (catena respiratoria mitocondriale) e TFAM (fattore di trascrizione mitocondriale A) in cellule fissate

1. Al termine del periodo di coltura, staccare le cellule (~10⁶) aggiungendo il reagente di dissociazione cellulare; quindi, pellettare e raccogliere le cellule in una provetta da 15 mL. Lavare le celle mediante centrifugazione con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (1x) due volte centrifugando a 300 × g per 5 minuti.
2. Fissare le cellule in paraformaldeide (PFA) all'1,6% (1 mL di PFA all'1,6% in una provetta da 15 mL) a temperatura ambiente (RT) per 10 min. Lavare le cellule mediante centrifugazione con PBS (1x) due volte centrifugando a 300 × g per 5 min.
3. Permeabilizzare le cellule con metanolo ghiacciato al 90% (1 mL di metanolo al 90% in una provetta da 15 mL) a -20 °C per 20 min.
4. Bloccare i campioni nel tampone bloccante contenente 0,3 M di glicina, 5% di siero di capra e 1% di albumina sierica bovina (BSA) - Frazione V in PBS (1x) (1 mL di tampone bloccante in una provetta da 15 mL). Lavare le celle mediante centrifugazione con PBS (1x) due volte.
5. Incubare le cellule con i seguenti anticorpi primari per 30 minuti: anti-NDUFB10 (1:1.000) per la misurazione della subunità del complesso I, subunità A della flavoproteina del complesso anti-succinato deidrogenasi (SDHA, 1:1.000) per la misurazione della subunità del complesso II e anti-COX IV (1:1.000) per la misurazione della subunità del complesso IV e anticorpo anti-TFAM (fattore di trascrizione mitocondriale A) coniugato con Alexa Fluor 488 (1:400). Colorare separatamente lo stesso numero di cellule con l'anticorpo anti-TOMM20 (translocasi della membrana mitocondriale esterna 20) coniugato con Alexa Fluor 488 (1:400) per 30 minuti (1 ml di soluzione di anticorpi primari in una provetta da 15 ml; vedere la Tabella dei materiali per i dettagli sugli anticorpi).
6. Lavare le cellule con PBS (1x) una volta con centrifugazione a 300 × g per 5 minuti. Aggiungere l'anticorpo secondario (1:400) in provette di NDUFB10, SDHA e COX IV e incubare le cellule con queste soluzioni per 30 minuti.
7. Lavare le cellule con PBS (1x) una volta centrifugando a 300 × g per 5 minuti. Aspirare i surnatanti, lasciando circa 100 μl nelle provette. Risospendere i pellet di cella in 300 μL di PBS (1x). Trasferire le cellule in provette da microcentrifuga da 1,5 mL tenute al buio su ghiaccio.
8. Analizzare le cellule sul citometro a flusso (con una configurazione laser a 3 blu e 1 rosso). Rileva i segnali nel filtro 1 (FL1) utilizzando un filtro passa-banda 530/30.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-TFAM coniugato con Alexa Fluor 488	Abcam	AB198308	anticorpi primari; utilizzare come soluzione colorante 1:400, 2,5 μL in 1000 μL; utilizzare il monoclonale di topo IgG2b Alexa Fluor® 488 come controllo isotipico.
anti-TOMM20 coniugato con Alexa Fluor 488	Santa Cruz Biotecnologia	Gatto# sc-17764 RRID:AB_628381	anticorpi primari; utilizzare come soluzione colorante 1:400, 2,5 μL in 1000 μL; utilizzare il monoclonale di topo IgG2a Alexa Fluor® 488 come controllo isotipico.
anti-NDUFB10	Abcam	ab196019	anticorpi primari; utilizzare come soluzione colorante 1:1000, 1 μL in 1000 μL; utilizzare Alexa Fluor ® 488 capra anti-coniglio IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalogo # A-11008) come anticorpo secondario; utilizzare le IgG monoclonali di coniglio come controllo isotipico.
anti-SDHA	Abcam	ab137040	anticorpi primari; utilizzare come soluzione colorante 1:1000, 1 μL in 1000 μL; utilizzare Alexa Fluor ® 488 capra anti-coniglio IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalogo # A-11008) come anticorpo secondario; utilizzare le IgG monoclonali di coniglio come controllo isotipico.
anti-COX IV	Abcam	ab14744, RRID:AB_301443	anticorpi primari; utilizzare come soluzione colorante 1:1000, 1 μL in 1000 μL; utilizzare Alexa Fluor ® 488 capra anti-topo IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalogo # A-11001) come anticorpo secondario; utilizzare le IgG monoclonali di topo come controllo isotipico.
PBS 1x	Thermo Fisher Scientific	18912014	Utilizzato per le fasi di lavaggio
Formaldeide (PFA) 16%	Thermo Fisher Scientific	28908	Fissazione cellulare
Glicina	Sigma-Aldrich	G8898	Utilizzato nel buffer di blocco
Albumina sierica bovina	Europa Bioproducts	EQBAH62-1000	Agente bloccante per prevenire il legame non specifico degli anticorpi nei saggi di immunocolorazione e nell'ingrediente CDM