Misurazione di più parametri mitocondriali nei neuroni mediante citometria a flusso

Abstract

Fonte: Liang, K. X., et al. Analisi citometrica a flusso di più parametri mitocondriali in cellule staminali pluripotenti indotte umane e loro derivati neurali e gliali. J. Vis. Exp. (2021)

Questo video mostra la marcatura delle cellule neuronali con anticorpi per i complessi della catena respiratoria mitocondriale, la proteina associata al DNA mitocondriale e la proteina della membrana esterna mitocondriale, seguita da citometria a flusso per quantificarne i livelli.

Protocol

1. Misurazione della citometria a flusso delle subunità del complesso MRC (catena respiratoria mitocondriale) e TFAM (fattore di trascrizione mitocondriale A) in cellule fissate

1. Al termine del periodo di coltura, staccare le cellule (~10⁶) aggiungendo il reagente di dissociazione cellulare; quindi, pellettare e raccogliere le cellule in una provetta da 15 mL. Lavare le celle mediante centrifugazione con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (1x) due volte centrifugando a 300 × g per 5 minuti.
2. Fissare le cellule in paraformaldeide (PFA) all'1,6% (1 mL di PFA all'1,6% in una provetta da 15 mL) a temperatura ambien....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-TFAM coniugato con Alexa Fluor 488	Abcam	AB198308	anticorpi primari; utilizzare come soluzione colorante 1:400, 2,5 μL in 1000 μL; utilizzare il monoclonale di topo IgG2b Alexa Fluor® 488 come controllo isotipico.
anti-TOMM20 coniugato con Alexa Fluor 488	Santa Cruz Biotecnologia	Gatto# sc-17764 RRID:AB_628381	anticorpi primari; utilizzare come soluzione colorante 1:400, 2,5 μL in 1000 μL; utilizzare il monoclonale di topo IgG2a Alexa Fluor® 488 come controllo isotipico.
anti-NDUFB10	Abcam	ab196019	anticorpi primari; utilizzare come soluzione colorante 1:1000, 1 μL in 1000 μL; utilizzare Alexa Fluor ® 488 capra anti-coniglio IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalogo # A-11008) come anticorpo secondario; utilizzare le IgG monoclonali di coniglio come controllo isotipico.
anti-SDHA	Abcam	ab137040	anticorpi primari; utilizzare come soluzione colorante 1:1000, 1 μL in 1000 μL; utilizzare Alexa Fluor ® 488 capra anti-coniglio IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalogo # A-11008) come anticorpo secondario; utilizzare le IgG monoclonali di coniglio come controllo isotipico.
anti-COX IV	Abcam	ab14744, RRID:AB_301443	anticorpi primari; utilizzare come soluzione colorante 1:1000, 1 μL in 1000 μL; utilizzare Alexa Fluor ® 488 capra anti-topo IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalogo # A-11001) come anticorpo secondario; utilizzare le IgG monoclonali di topo come controllo isotipico.
PBS 1x	Thermo Fisher Scientific	18912014	Utilizzato per le fasi di lavaggio
Formaldeide (PFA) 16%	Thermo Fisher Scientific	28908	Fissazione cellulare
Glicina	Sigma-Aldrich	G8898	Utilizzato nel buffer di blocco
Albumina sierica bovina	Europa Bioproducts	EQBAH62-1000	Agente bloccante per prevenire il legame non specifico degli anticorpi nei saggi di immunocolorazione e nell'ingrediente CDM