Saggio della luciferasi per misurare l'attività della γ-secretasi nelle cellule umane

Abstract

Fonte: Wang, B., et al., Misurazione quantitativa della proteina precursore dell'amiloide mediata dalla γ-secretasi e della scissione di Notch nelle piattaforme di analisi reporter della luciferasi basate su cellule. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video mostra la procedura di misurazione dell'attività della γ-secretasi in cellule umane geneticamente modificate utilizzando un sistema inducibile da tetraciclina. Il processo prevede l'induzione dell'espressione genica di APP con tetraciclina, la generazione di peptidi amiloidi-β e l'attivazione della produzione di luciferasi. Viene quindi misurata la bioluminescenza risultante dalla reazione luciferasi-substrato, che riflette l'attività della γ-secretasi.

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Misurazione dei segnali reporter della luciferasi, che corrispondono alla scissione della γ-secretasi di APP-C99 ( proteina precursore dell'amiloide - Fragment 99-amino acid)

NOTA: Si prega di fare riferimento alle pubblicazioni precedenti per descrizioni dettagliate della generazione di celle CG (C99-Gal4).

1. Seminare cellule CG (20.000 cellule/pozzetto) su micropiastre da 96 pozzetti a un volume finale di 200 μL/pozzetto in terreno di crescita composto da Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) più il 10% di siero fetale bovino (FBS), 5 μg/mL di blasticidina, 250 μg/mL di antibiotico (e.g., zeocin), e 200 μg/mL di igromicina B.
   1. Contare le cellule con un emocitometro.
   2. Trasferire le micropiastre in un incubatore umidificato a base di CO₂ e incubare a 37 °C per una notte.
2. Rimuovere 100 μL di terreno di coltura da ciascun pozzetto.
3. Aggiungere 100 μL/pozzetto di terreno di crescita contenente 2 μg/mL di tetraciclina con dimetilsolfossido (DMSO) allo 0,2%, 2 μM CL-387,785, 2 μM N-[N-(3,5-difluorofenacetil-L-alanil)]-S-fenilglicina t-butilestere (DAPT) o altri inibitori ErbB1/ErbB2 correlati.
4. Incubare le cellule CG trattate in micropiastre a 37 °C per 24 ore.
5. Rimuovere 150 μl/pozzetto di terreno di crescita dalle micropiastre.
6. Aggiungere 50 μL/pozzetto di reagente per il saggio della luciferasi (vedere Tabella dei materiali).
7. Trasferire le micropiastre in un lettore di micropiastre a luminescenza.
   1. Mantenere le micropiastre a temperatura ambiente per 5 minuti agitando delicatamente.
8. Determinare la luminescenza emessa dalla luciferasi (FL) Firefly utilizzando un programma predefinito memorizzato nel lettore di micropiastre di luminescenza.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Lettore di lastre a luminescenza VictorLight	PerkinElmer	2030-0010
Cabina di sicurezza biologica di classe II, tipo 2	Thermo Scientific	Serie 1300 A2
CL-387,785	EMD Calbiochem	233100-1MG
DAPT	Merck	565770
Eagle Medium modificato di Dulbecco (DMEM)	Thermo Fisher	12100046	Componente principale del terreno di crescita
Siero fetale bovino (FBS)	Thermo Fisher	16000044
Blasticidina	Thermo Fisher	A1113903
Zeocin	Thermo Fisher	R25005
Igromicina B	Gibco	10687010
Emocitomero	Sigma-Aldrich	BR717805 Aldrich
Micropiastra a 96 pozzetti	Nunc	156545
Tetraciclina	Sigma	T7660
Dimetilsolfossido (DMSO)	Sigma	D2650
Reagente per il dosaggio della luciferasi Steady-Glo	Promega	E2510
Incubatore a CO2 umidificato	Revco	Ultima II
Linea cellulare T-REx293	Invitrogen	R71007
Wallac 1420 versione software 3.0	PerkinElmer		Software di controllo dello strumento del lettore di micropiastre a luminescenza