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Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Affettatura del cervello
- Per immobilizzare e anestetizzare i topi mediante l'applicazione di isoflurano al 3%.
- Immergere un batuffolo di cotone con gocce di isoflurano e metterlo in una provetta da microcentrifuga da 15 ml. Metti il naso dell'animale nel tubo e lascialo inalare l'isoflurano. Controllare la profondità dell'anestesia in base alla mancanza di risposta al pizzicamento delle dita.
- Posiziona l'animale sulla schiena e immobilizzalo bloccando le sue estremità con uno spillo a T mentre ha accesso al suo addome.
- Taglia l'animale con le forbici chirurgiche, tagliando la pelle addominale e tagliando la pelle nella regione del torace. Appunta la pelle verso il basso usando i perni a T. Quindi, rompere la membrana peritoneale fino al torace. Esporre il cuore rompendo la cavità toracica e tagliando il diaframma.
- Taglia l'atrio destro per consentire al sangue di defluire dall'animale. Inserire una siringa da 10 ml con un ago calibro 25 nel ventricolo sinistro e perfondere con 10 ml di soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS).
NOTA: Ciò consente alla soluzione di fluire attraverso la circolazione sistemica e di uscire attraverso l'atrio destro.
- Rimuovere la siringa da 10 ml e inserire un ago calibro 25 collegato alla siringa da 60 ml. Perfondere attraverso il ventricolo sinistro con 50 ml di paraformaldeide (PFA) al 4% ghiacciata.
- Preparare una soluzione ghiacciata di PFA al 4% diluendo la soluzione di PFA al 10% in H2O e raffreddando la soluzione finale di PFA al 4% a 4 °C.
- Isolare la testa del topo e rimuovere il cervello dal cranio.
- Taglia la pelle dal collo, quindi taglia verso gli occhi per esporre il cranio. Rompi il cranio dal collo al naso e poi da un bulbo oculare all'altro. Staccare il cranio e asportare l'intero cervello.
- Incubare il cervello in PFA al 4% per 24 ore a 4 °C.
- Trasferire il cervello con una pinza in una provetta conica da 50 mL riempita con 25 mL di soluzione di saccarosio al 30%. Tenerlo a 4 °C per 48-72 ore fino a quando il cervello affonda sul fondo del tubo.
- Tagliare il cervello con una matrice di affettatore cerebrale di topo adulto coronale attraverso il mesencefalo (~3 mm dietro il bregma). Conserva la sezione cerebrale contenente il tronco encefalico.
NOTA: Questo si tradurrà in due sezioni cerebrali - una contenente la maggior parte della corteccia (anteriore del taglio) e una contenente il tronco encefalico/cervelletto (posteriore del taglio). Utilizzare la sezione del tronco encefalico per i seguenti passaggi.
- Incorporare la sezione del tronco encefalico con la superficie di taglio posizionata sul fondo di uno stampo da inclusione, circondata da un composto a temperatura di taglio ottimale (OCT); Spostare il cervello incorporato in un congelatore a -80 °C e congelare per almeno 12 ore, fino a nuovo utilizzo.
- Taglio al criostato: posizionare lo stampo di inclusione contenente il cervello in OCT nel criostato; Incubarlo nel criostato per diverse ore per regolare la temperatura del blocco cerebrale a quella del criostato.
- Staccare lo stampo di inclusione per esporre il blocco OCT contenente il cervello.
- Usa le lame di rasoio per rimuovere l'OCT in eccesso dalla superficie del blocco senza toccare il cervello.
- Montare il blocco OCT sul mandrino del criostato, esponendo la superficie di taglio del cervello verso la parte anteriore.
- Regolare la superficie di taglio del cervello in modo che sia orientata parallelamente alle lame di rasoio del criostato.
- Tagliare il cervello iniziando dal midollo, tagliando sezioni di 100 μm rostralmente.
- Tagliare rostralmente fino a quando il cervelletto e il tronco encefalico sono tagliati come una fetta continua. Iniziare a raccogliere fette a 50 μm di spessore.
NOTA: Quando si taglia rostralmente dal midollo, il tronco encefalico e il cervelletto saranno tagliati in due sezioni separate. Nelle sezioni rostrali, il tronco encefalico e il cervelletto finiranno per fondersi a livello del 4° ventricolo. Una volta che i bordi laterali del 4° ventricolo sono ben formati, il cervelletto e il tronco encefalico usciranno come un'unica fetta continua.
- Raccogli una fetta di cervello circondata da OCT con una pinza e mettila in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti riempita di PBS (Figura 1a). Il locus coeruleus (LC) sarà più prominente quando il cervelletto e il collicolo inferiore si incontrano a ~-5,52 mm dietro la bregma (Figura 2b).
NOTA: La parte più anteriore del LC scomparirà una volta che il cervelletto sarà stato completamente sezionato e non circonderà più il collicolo inferiore a ~-5,34 mm posteriormente alla bregma (Figura 2c).
2. Immunoistochimica della dopamina β-idrossilasi (DBH) o della tirosina idrossilasi (TH) (Figura 1)
- Giorno 1
- Lavare le fette selezionate tre volte per 5 minuti in PBS.
- Permeabilizzare per 24 ore in soluzione salina tamponata con fosfato allo 0,5% con detergente (PBSD) a 4 °C.
- Diluire 125 μL di detergente in 25 mL di PBS.
- Giorno 2
- Lavare le fette tre volte per 5 minuti allo 0,5% di PBSD.
- Aggiungere l'anticorpo primario, anti-DBH o anti-TH, per 18 ore a una diluizione di 1:500 in PBSD allo 0,5% a 4 °C.
- Giorno 3
- Lavare le fette tre volte per 10 minuti allo 0,5% di PBSD.
- Aggiungere l'anticorpo secondario desiderato (488 asino anti-coniglio per fluorescenza verde) alla diluizione di 1:1000 in PBSD allo 0,5% per 16 ore.
- Avvolgere la piastra a 24 pozzetti in alluminio e posizionarla a 4 °C.
- Lavare le fette tre volte per 5 minuti allo 0,5% di PBSD.
- Lavare per 5 minuti in PBS.
- Trasferisci le fette con un pennello a matita in un contenitore per l'acqua.
- Monta fette che galleggiano nell'acqua su scivoli carichi.
- Sezioni di vetrino coprioggetti con terreno di montaggio rigido Dopamina beta-idrossilasi
- Asciugare le sezioni cerebrali montate per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Immagini di sezioni cerebrali su un microscopio confocale o fluorescente con impostazioni per rilevare i segnali dalla lunghezza d'onda appropriata del fluoroforo dell'anticorpo secondario.
- Regolare il microscopio sul piano focale della fetta cerebrale e scattare una singola immagine con un ingrandimento 10X.
