Marcatura mediata da virus e trapianto di cellule di eminenza gangliare mediale per studi in vivo

Abstract

Fonte: Vogt, D. et al., Etichettatura e trapianto mediati da virus di cellule di eminenza gangliare mediale (MGE) per In vivo Studi. J. Vis. Exp. (2015).

Questo video dimostra la marcatura virale e il trapianto di cellule di eminenza gangliare mediale (MGE) per studi in vivo. Delinea i passaggi coinvolti nella trasduzione delle cellule MGE con un reporter virale, trapiantando queste cellule trasdotte nella corteccia di un cucciolo di topo e consentendo l'espressione del reporter in specifici sottotipi di interneuroni.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione del lentivirus (passaggio opzionale)

1. Dividere tre piastre da 10 cm di cellule HEK293T per ogni lentivirus da produrre in presenza di 10 ml di DMEM/10% FBS e crescere fino a ~60-70% di confluenza. Far crescere le cellule in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO₂.
2. Trasfettare i seguenti plasmidi di DNA (10 μg in totale) in ciascuna piastra utilizzando qualsiasi reagente di trasfezione: 6,4 μg di vettore lentivirale CAG-Flex-GFP, 1,2 μg di pMD2.G (codifica VSV-g), 1,2 μg di pRSV-Rev e 1,2 μg di pMDLg/pRRE. I tre vettori di confezionamento lentivirali sono disponibili in commercio.
   nota: Questo approccio utilizza vettori lentivirali di terza generazione, ma funzioneranno anche vettori di seconda generazione e plasmidi associati.
3. Preparare un contenitore per rifiuti contenente una soluzione di candeggina al 10% all'interno di una cappa certificata BSL2 per inattivare qualsiasi soluzione o dispositivo che sia entrato in contatto o contenga lentivirus. Quindi, rimuovere completamente il terreno 4-6 ore dopo la trasfezione nella soluzione di candeggina, sostituirlo con lo stesso volume di nuovo terreno e lasciare che le cellule crescano.
4. Dopo 4 giorni, raccogliere il terreno in provette coniche da 50 ml e centrifugare a 1.000 x g per 15 minuti per pellettare eventuali detriti cellulari. Quindi, filtrare il surnatante attraverso una membrana da 0,45 μm. Qualsiasi filtro a basso legame proteico, come il PVDF, funziona bene. cautela: Metti i rifiuti virali solidi e liquidi nella soluzione di candeggina.
5. Caricare 30 ml di surnatante filtrato nelle provette dell'ultracentrifuga e in un'ultracentrifuga. Centrifugare a 100.000 x g per 2,5 ore a 4 °C. Aprire le provette da centrifuga in una cappa BSL2 e rimuovere il surnatante in candeggina al 10%. Aggiungere ~100 μl di PBS al pellet, che produce titoli da 1x10⁷ a 1x10⁸ unità infettive/ml. Aliquotare il giorno seguente e conservare a -80 ºC. Le aliquote di lentivirus sono stabili a -80 °C per almeno sei mesi.
6. Considerazione importante: molte istituzioni ora hanno nuclei virali. Acquisire il virus concentrato con un titolo minimo di 1x10⁷ unità infettive/ml, per risultati ottimali.

2. Topi donatori per dissezione MGE

1. Innanzitutto, impostare un accoppiamento temporizzato tra una linea di interesse che esprime Cre e un topo wild type (WT) o un topo che esprimerà un reporter dopo la ricombinazione mediata da Cre.
   nota: Molte linee Cre-driver sono transgeniche e vengono mantenute e allevate allo stato emizigote. Pertanto, solo la metà degli embrioni conterrà il transgene Cre. Il DNA può essere preparato rapidamente dagli embrioni per una breve PCR per rilevare l'allele Cre. Gli embrioni Cre⁺ possono quindi essere raccolti in modo da utilizzare solo il tessuto MGE del genotipo desiderato. In alternativa, è possibile utilizzare un reporter Cre-dipendente per selezionare gli embrioni per la dissezione e il trapianto di MGE.
2. Calcola quale giorno corrisponderà a E13.5. Se gli animali sono stati accoppiati la sera prima, il giorno della spina è 0,5. Ordina topi gravidi a tempo o una femmina WT con cuccioli P1 per cronometrare la presenza di topi (P)1 postnatali il giorno in cui il tessuto donatore sarà E13.5. In alternativa, organizza questi accoppiamenti in casa una settimana prima di accoppiare gli animali donatori.
   nota: La prima strategia di generare embrioni/cuccioli E13.5 e P1 per lo stesso giorno è spesso difficile da eseguire in modo affidabile.

3. Preparazione di supporti, strumenti e attrezzature.

1. Preparare i reagenti e gli strumenti per la preparazione delle cellule MGE (Tabella 1).
   1. Preparare una superficie pulita e posizionare sulla superficie una pinza, forbici pulite e un bisturi microchirurgico o una pinza fine (per una dissezione precisa dei tessuti).
   2. Preparare la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) per la dissezione e il terreno di aquila modificato di Dulbeco (DMEM) con il 10% di siero fetale bovino (FBS) per la trasduzione.
   3. Preincubare 20-30 ml di DMEM/10% FBS in un incubatore per colture tissutali a 37 °C per circa 1 ora. Il coperchio deve essere allentato per consentire lo scambio gassoso e l'equilibrio del pH del terreno.
      nota: La preincubazione del terreno può essere preparata appena prima di iniziare la dissezione.

4. Preparazione delle cellule MGE

1. Sacrificare la topolina incinta secondo un protocollo animale approvato e rimuovere gli embrioni in una capsula di Petri di 10 cm contenente HBSS ghiacciato.
2. Rimuovere il cervello da ogni embrione utilizzando un cannocchiale da dissezione (eseguirne uno alla volta, lasciando il resto degli embrioni in HBSS ghiacciato) e quindi procedere a tagliare il tessuto MGE.
   nota: Di seguito e nella Figura 1 sono descritti in dettaglio i passaggi chiave che mostrano come rimuovere l'MGE.
   1. Posizionare il cervello con il lato ventrale rivolto verso l'alto (Figure 1A, A'). Nota: va bene anche avere l'aspetto dorsale rivolto verso l'alto. Taglia il cervello a metà lungo il piano sagittale per generare due pezzi. Viene mostrato un esempio di cervello emiseccitato (Figure 1B, B'); Si noti che gli aspetti dorsale (la corteccia sovrastante) e ventrale del cervello coprono e circondano il tessuto dell'eminenza gangliare (GE).
   2. Successivamente, con una mano dominante, impugnare una pinza molto sottile o un coltello da taglio (Tabella 1) mentre immobilizza l'emisfero con una pinza tenuta da una mano non dominante. (L'aspetto mediale dell'emisfero dovrebbe essere rivolto verso l'alto). Aprire il tessuto dorsale e ventrale con una pinza e un coltello da taglio per rivelare il tessuto GE sottostante (Figura 1C e diagramma nella Figura 1C').
      nota: La rimozione di alcuni terreni dalla capsula di Petri per la dissezione può facilitare la stabilizzazione del tessuto durante l'esecuzione della dissezione MGE.
   3. Eseguire tagli dritti con il coltello da taglio o con una pinza fine per separare il CGE, l'LGE e i tessuti del setto nasale (vedere i tagli di esempio indicati da linee tratteggiate rosse, Figure 1D e D'). Questi tagli possono essere eseguiti in qualsiasi ordine.
      nota: Immaginate l'MGE come una "scatola" che viene ritagliata dal tessuto circostante. In questo modo è possibile eseguire in modo riproducibile tagli simili per ogni dissezione, riducendo così la variabilità delle dissezioni tissutali.
   4. Infine, gira l'MGE su un lato e taglia la parte inferiore (quello che era l'aspetto laterale del cervello). Questo rimuove la zona del mantello dell'MGE (scartarla nelle Figure 1E e 1E') dal resto dell'MGE. L'aspetto rimanente della MGE contiene principalmente porzioni della zona ventricolare e della zona subventricolare della MGE, che contengono quasi tutte le cellule progenitrici della MGE. Procedi con questo fazzoletto.
3. Considerazione importante: l'aggiunta di gel di silicone sul fondo di una capsula di Petri può fungere da eccellente superficie di dissezione in quanto protegge le delicate punte delle pinze e fornisce una superficie morbida per bloccare i tessuti con le pinze.

5. Marcatura e trapianto di lentivirali

1. Spostare le provette di tessuto MGE in una cappa certificata BSL2 e rimuovere il terreno.
   nota: Il tessuto MGE è abbastanza grande da essere visibile e si depositerà sul fondo della provetta, consentendo di rimuovere facilmente e delicatamente il mezzo freddo.
2. Aggiungere ~500 μl di terreno DMEM/10% FBS, che è stato preincubato in un incubatore di coltura tissutale a 37 °C. Quindi, aggiungere il polibrene per facilitare la trasduzione in ciascuna provetta a una concentrazione finale di 8 μg/ml. Triturare il tessuto MGE per creare una sospensione a singola cellula utilizzando un puntale per pipetta P1000. Infine, aggiungere ~15-20 μl di lentivirus concentrato a ciascuna provetta.
3. Considerazione importante: una triturazione di 10-12 volte è sufficiente per rompere il tessuto MGE da un singolo embrione, ma potrebbero essere necessarie più triturazioni se più MGE vengono raggruppate insieme. Prova diverse condizioni di triturazione per determinare quella che funziona meglio.
4. Chiudere saldamente ogni provetta, capovolgerla per mescolare, quindi posizionare tutte le provette in un'incubatrice a 37 °C. Incubare le cellule nel lentivirus per almeno 30 minuti e fino a 1 ora, tempi più lunghi hanno portato a una diminuzione della vitalità cellulare. Capovolgere i tubi ogni 10 minuti fino allo scadere del tempo.
5. Dopo l'incubazione con lentivirus, rimuovere le provette dall'incubatore e centrifugare a ~700 x g per 3 minuti per pellettare le cellule. Nella cappa BSL2, rimuovere il surnatante e gettarlo in candeggina al 10%. Quindi, aggiungere 1 ml di DMEM/10% FBS e triturare il pellet 2-3 volte per lavarlo, quindi centrifugare nuovamente alla stessa velocità per pellettare le cellule. Ripetere questa fase di lavaggio altre 2-3 volte per rimuovere il virus in eccesso.
   nota: Eseguire le fasi di centrifugazione a 4 °C; tuttavia, non è stata osservata una ridotta vitalità quando vengono eseguiti brevi spin a RT.
6. Dopo il lavaggio finale, rimuovere quanto più terreno possibile e mettere ogni tubo sul ghiaccio. A causa del terreno residuo sui lati della provetta, ~2-3 μl di terreno finiranno per coprire il pellet cellulare al momento dell'inizio della procedura di trapianto.

6. Trapianto e convalida

1. Acquisire i cuccioli dell'ospite P1 e preparare l'area della procedura spruzzando con etanolo al 70%. Per mantenere la sterilità durante la procedura, si consiglia di eseguire queste procedure in una sala operatoria pulita dedicata. Inoltre, utilizzare strumenti chirurgici autoclavati e sterilizzare le superfici con cui i cuccioli saranno a contatto, utilizzando il 70% di etanolo. Un esempio di attrezzatura rappresentativa necessaria per eseguire i trapianti e un'area di procedura rappresentativa è mostrato nella Figura 2.
   Nota: sebbene questa procedura sia un'iniezione di piccoli volumi e non una procedura chirurgica che richiederebbe un'incisione, una ferita aperta o punti di sutura, si raccomanda comunque di utilizzare una nuova micropipetta per ogni topo da iniettare. Le micropipette vengono sterilizzate a caldo quando vengono tirate e smussate su una superficie spruzzata con etanolo al 70% e conservate in un contenitore sigillato.
   1. Generare micropipette con un diametro del puntale compreso tra 40 e 80 μm. Seguendo queste dimensioni si otterranno risultati ottimali. Sterilizzare a caldo le micropipette quando vengono tirate e smussate su una superficie e spruzzare con etanolo al 70% prima di conservare le micropipette in un contenitore sigillato.
      Nota: In alternativa, se l'accesso ai dispositivi necessari per creare questi aghi (Tabella 1) è limitato, utilizzare qualsiasi altro dispositivo di iniezione. Tuttavia, queste potrebbero non essere adatte come le micropipette a causa dei diversi diametri.
   2. Aspirare l'olio minerale in una siringa da 1 ml e, con un ago da 30 1/2 G, riempire completamente la pipetta di vetro con olio minerale. Quindi, montare lo stantuffo sul dispositivo stereotassico, quindi collegare la pipetta di vetro al dispositivo stereotassico e caricarla sullo stantuffo. Utilizzando l'azionamento idraulico, spostare lo stantuffo di circa metà nella pipetta di vetro, rimuovendo l'olio minerale che fuoriesce con un tovagliolo di carta pulito.
      1. In alternativa all'uso di una siringa, immergere l'estremità posteriore della pipetta in olio minerale e riempire con azione capillare. Per evitare la formazione di bolle d'aria nella pipetta, mantenere una pressione positiva sulla siringa fino a quando non è completamente fuori dalla pipetta di vetro.
         nota: Altri dispositivi possono essere utilizzati per trapiantare con successo le cellule MGE. Qualsiasi dispositivo in grado di erogare un volume inferiore o vicino a 100 nl funziona bene per questa procedura.
   3. Quindi, utilizzare un tovagliolo di carta sterile o qualsiasi materiale assorbente, con l'angolo attorcigliato in una punta sottile per rimuovere delicatamente il terreno in eccesso sopra il pellet di cellule MGE. Questa fase concentra la densità cellulare in modo da ottenere volumi di iniezione più piccoli. Quindi, utilizzare una pipetta a basso volume (preferibilmente P2) per aspirare lentamente il pellet cellulare e triturare 1-2 volte prima di spostare la sospensione cellulare su una superficie idrofoba. Il volume dovrebbe essere di poco inferiore a 1 μl. Spostare la punta dell'ago nella sospensione cellulare e, utilizzando l'azionamento idraulico, aspirare la sospensione cellulare nella pipetta.
   4. Anestetizzare un cucciolo P1 tramite ipotermia (avvolgere in un guanto di lattice e mettere sul ghiaccio per ~ 2-4 minuti). Verificare l'efficacia dell'anestesia con uno stimolo nocivo. Pizzicare la pelle tra le dita dei piedi con una pinza sottile: il cucciolo dovrebbe non rispondere se pizzicato. Quindi, posiziona il cucciolo su uno stampo che si trova sotto il dispositivo di iniezione, quindi rendi la pelle tesa tirando indietro la pelle sulla testa e fissandola con nastro da laboratorio standard><. nota: Sebbene l'ipotermia sia molto efficace sui topi neonatali e si traduca in un basso tasso di mortalità, le procedure devono essere eseguite rapidamente, poiché i cuccioli inizieranno a riprendersi in meno di 10 minuti. Inoltre, 4 minuti sul ghiaccio sono un limite massimo di ciò che può essere tollerato. Cerca di indurre l'ipotermia solo una volta se è necessario un tempo più lungo per le iniezioni. Tuttavia, se un cucciolo si riprende presto, prima di lasciarlo riprendersi completamente prima di indurre nuovamente l'ipotermia. Inoltre, indurre l'ipotermia solo un'altra volta per eseguire le iniezioni. I cuccioli si riprenderanno entro 5-10 minuti dall'ipotermia. Questo può essere facilitato posizionando i cuccioli con la cucciolata e la mamma o posizionando il cucciolo su una superficie calda per riprendersi.
   5. Utilizzando un dispositivo stereotassico, posizionare la punta della pipetta di vetro sulla superficie della testa del cucciolo, perpendicolarmente alla superficie della testa. Quando la pipetta è a contatto con la testa, considerare questo valore come "0". Quindi, spingere la pipetta attraverso la superficie della pelle e del cranio nella corteccia, quindi inserire e ritrarre la pipetta ~ 2 volte prima di fermarsi. Per un targeting ottimale delle cellule nella neocorteccia, le iniezioni vengono eseguite quando la micropipetta si trova a una profondità di 0,1 mm. Tuttavia, questo dovrebbe essere ottimizzato dall'utente (vedi nota sotto).
      nota: Sebbene questa profondità si rivolga in modo affidabile agli strati neocorticali più profondi con i dispositivi sopra descritti, alcune profondità dovrebbero essere testate e determinate empiricamente. Inoltre, è necessario testare una gamma di profondità in diverse posizioni rostro-caudali e medio-laterali per determinare quale profondità è ottimale in ciascun sito. Inoltre, la puntura iniziale dovrebbe essere rapida, poiché la penetrazione lenta nella neocorteccia diminuisce la capacità di penetrare in modo pulito nel tessuto. Prova velocità diverse quando avvii questa procedura per la prima volta per trovare quella che funziona meglio. Inoltre, per testare le coordinate, non esiste un vero sostituto per l'uso di celle etichettate, poiché i coloranti sono stati inaffidabili per indicare la posizione.
   6. Una volta che l'ago è in posizione, ruotare il dispositivo idraulico per far avanzare lo stantuffo nella pipetta di vetro, spingendo un determinato volume di sospensione cellulare nella corteccia. Iniettare 50-70 nls per sito. Ripetere questa procedura in 3-6 siti diversi a diversi livelli rostrale-caudali se l'obiettivo è ottenere un'ampia distribuzione di cellule in tutta la neocorteccia><. nota: Volumi di 100 nl o superiori possono causare lesioni e portare a grandi grumi di cellule iniettate che non riescono a migrare in modo efficiente fuori dal sito di iniezione. Pertanto, volumi di iniezione più piccoli (~70 nl o meno) sono ottimali, su più siti se il tempo lo consente.
   7. Al termine delle iniezioni, rimuovere il cucciolo dal palco e contrassegnarlo (il taglio delle dita dei piedi è un modo affidabile per identificare i cuccioli in seguito). Una volta che il cucciolo si è ripreso ed è in grado di muoversi da solo (questo avviene entro pochi minuti dalla rimozione dal palco), rimettilo con la mamma e la cucciolata.
      nota: Poiché si tratta di una procedura minimamente invasiva, non ci sono procedure post-chirurgiche una volta che il cucciolo si muove liberamente e si riscalda. Tuttavia, i cuccioli dovrebbero essere controllati non solo dopo la procedura, ma anche il giorno successivo per assicurarsi che non abbiano segni di deterioramento della salute.
   8. Prima di iniziare la procedura sul cucciolo successivo, spruzzare l'area con etanolo al 70% per mantenere un'area di lavoro sterile. Lasciare che i cuccioli iniettati si sviluppino e quindi valutare il tessuto allo stadio di sviluppo appropriato.

Tabella 1. Elenco inventario di reagenti e strumenti.Un inventario di reagenti disponibili in commercio, tra cui terreni, strumenti di dissezione, apparecchiature rappresentative per i trapianti e vettori di DNA. (n.d.) Non disponibile o applicabile.

Reagenti e attrezzature per la preparazione e la trasduzione delle cellule MGE			Catalogo #	società
1)	Dulbecco's Modified Eagle Medium, con glucosio alto		Codice 12491-015	Tecnologie per la vita
2)	Siero Fetale Bovino Inattivato a Caldo		Codice 10437-077	Tecnologie per la vita
3)	Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS), senza calcio o magnesio		Codice 14170-112	Tecnologie per la vita
4)	1.5 ml provette per microcentrifuga (o altre provette di raccolta con coperchio)		3810X	Eppendorf International
5)	Polybrene		SC-134220	SantaCruz Biotecnologie
6)	Coltello da pugnalata dritto 22.5 ° (opzionale)		Codice 72-2201	Società di specialità chirurgiche
7)	Piastra di Petri (10 cm), per dissezioni tissutali		FB0875713	Fisher Scientifico
8)	2 pinze a punta fine, come Dumont #5		Codice 11254-20	Strumenti scientifici di qualità
9)	37 °C incubatore per colture tissutali con ingresso al 5% di CO2		C150	raccoglitore
10)	Centrifuga da tavolo in grado di centrifugare provette per microcentrifuga da 1,5 ml
11)	Qualsiasi pipetta P1000 che può essere utilizzata per la triturazione cellulare
12)	Cappuccio di livello 2 di biosicurezza
Reagenti e attrezzature per colture primarie MGE in vitro			Catalogo #	società
1)	Vetrini per camera Lab-TekII con coperchio, 8 pozzetti		154941	Thermo Fisher
2)	Poli-L-lisina 0.1% peso/volume		P8920	Sigma Aldrich
3)	Laminina di topo, 0.5-2 mg/ml		Codice 23017-015	Tecnologie per la vita
4)	Terreno neurobasale		Codice 21103-049	Tecnologie per la vita
5)	B27 integratore senza siero		17504044	Tecnologie per la vita
6)	Glutamax, 100x stock		Codice 35050-061	Tecnologie per la vita
7)	Penicillina-Streptomicina, 100x stock		Codice 15070-063	Tecnologie per la vita
8)	Glucosio, (preparare una soluzione al 25% in acqua)		G5400	Sigma Aldrich
Reagenti e attrezzature per il trapianto di cellule MGE			Catalogo #	società
1)	1 ml siringa		RIFERIMENTO 309602	BD, Becton Dickinson e compagnia
2)	30 1/2 G ago		305106	BD, Becton Dickinson e compagnia
3)	Foro di precisione per erogare 5 μl (viene fornito con stantuffo)		5-000-1005	Società scientifica Drummond
4)	Parafilm		PM-999	Poliscienze, Inc.
5) **	Stereomicroscopio con supporto		MZ6	Leica
6) **	Digitale solo per topi strumento stereotassico		Codice: 51725D	Compagnia di Stoelting
7) **	Micromanipolatore fine oleodinamico monoassiale		MO-10	Narishige
8)	Smussatrice rotante rivestita di diamante		n.d.	Fatto in casa
9)	Estrattore per pipette ad ago		730	Strumenti Kopf
10)	Olio minerale		n.d.	Qualsiasi farmacia o farmacia
11)	Qualsiasi pipetta e puntale in grado di misurare in modo affidabile 1 μl di volume
	** Questi sono i modelli che usiamo, ma molte altre configurazioni dovrebbero funzionare
Reagenti opzionali (per la produzione di Lentivirus)			Catalogo #	società
1)	25 mm, filtro da 0.45 μm		09-719B	Fisher Scientifico
2)	Provette da centrifuga ultra trasparenti (25 x 89 mm)		344058	Beckman Coulter®
3)	Lipofectamina 2000	(formato da 1,5 ml)	11668019	Invitrogen
Altri materiali di consumo disponibili in commercio			Catalogo #	società
1)	pMDLg/pRRE codifica plasmidi gag/pol		Codice: 12251	Addgene
2)	pRSV-Rev codifica plasmidi Rev		Codice: 12253	Addgene
3)	pMD2.G codifica per plasmidi VSVG		Codice: 12259	Addgene
4)	pAAV-Flex-GFP		Codice 28304	Addgene

Risultati

Figura 1. Procedura rappresentativa per la dissezione del tessuto E13.5 MGE. Esempio di dissezione di tessuto MGE per colture primarie o trapianti. (A-E) Immagini di dissezioni cerebrali E13.5 e (A'-E') per evidenziare le strutture e i passaggi importanti della procedura. (A, A') Cervello rappresentativo E13.5 visto dall'aspetto ventrale. La linea r...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagenti e attrezzature per il trapianto di cellule MGE
Siringa da 1 ml	RIFERIMENTO 309602	BD, Becton Dickinson e compagnia
Ago calibro 301/2	305106	BD, Becton Dickinson e compagnia
Foro di precisione per erogare 5 μl (viene fornito con stantuffo)	5-000-1005	Società scientifica Drummond
Parafilm	PM-999	Polysciences, Inc.
Stereomicroscopio con supporto a braccio **	MZ6	Leica
Digitale solo per topi strumento stereotassico **	51725D	Compagnia di Stoelting
Micromanipolatore fine oleodinamico monoassiale **	MO-10	Narishige
Smussatrice rotativa diamantata	n.a.	Prodotto in casa
Estrattore per pipette ad ago	730	Strumenti Kopf
Olio minerale	n.a.	Qualsiasi farmacia o farmacia
Tutte le pipette e i puntali in grado di misurare 1 μl di volume
** Questi sono i modelli particolari che usiamo, ma molte altre configurazioni dovrebbero funzionare
Reagenti opzionali (per la produzione di Lentivirus)
25 mm, filtro da 0,45 μm	09-719B	Fisher Scientific
Provette da centrifuga ultratrasparenti (25 x 89 mm)	344058	Beckman Coulter®
Lipofectamina 2000 (formato da 1,5 ml)	11668019	Invitrogen
Altri materiali di consumo disponibili in commercio
pMDLg/pRRE codifica plasmidi gag/pol	12251	Addgene
pRSV-Rev codifica plasmidi Rev	12253	Addgene
pMD2.G codifica per plasmidi VSVG	12259	Addgene
pAAV-Flex-GFP	28304	Addgene