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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Procedura pre-chirurgica
- Prima di iniziare l'intervento chirurgico, pulire tutto con etanolo al 70% per mantenere le condizioni sterili. Si consiglia il supporto termico utilizzando un termoforo.
- Anestetizzare i topi mediante iniezione intraperitoneale di cloralio idrato (400 mg/kg). Si raccomanda l'uso di meloxicam SR all'induzione e di buprenorfina al momento del recupero BID (bis in die, due volte al giorno) per almeno 24 ore.
- Radere i capelli con un tagliacapelli chirurgico. Fissare un mouse nel mouse e nell'adattatore per ratto neonatale utilizzando le barre auricolari e un morsetto per il naso.
nota: È fondamentale assicurarsi che la testa del mouse sia fissata in questa fase e non si muova fianco a fianco.
- Applicare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
2. Chirurgia stereotassica per l'impianto di cannule guida
- Posizionare l'adattatore per topo e ratto neonatale sull'apparato stereotassico. Praticare un'incisione agittalmente sulla pelle sopra il cranio usando un bisturi. Pulisci il sangue e il tessuto connettivo sul cranio usando un batuffolo di cotone umido.
- Determina le coordinate per la regione del cervello di interesse utilizzando l'atlante cerebrale. Prima di iniziare le misurazioni, assicurarsi che la linea mediana sia diritta in modo che la punta del trapano possa essere spostata AP e rimanere sulla sutura della linea mediana per tutto il tempo.
nota: Questo articolo utilizza le coordinate (A/P: -3,1 mm, M/L: -2,5 mm, D/V: -1,2 mm, 12 gradi) per mirare all'ippocampo posteriore.
- Livello teschio A-P
- Attacca un trapano su un manipolatore di un telaio stereotassico. Abbassare il trapano fino a toccare delicatamente lambda e registrare le sue coordinate ventrali. Ripetere questa procedura per bregma.
nota: Quando il cranio è livellato, la misura verticale della bregma è uguale a quella della lambda. In caso contrario, regolare di conseguenza l'altezza del morsetto per il naso. Dopo che il cranio è stato livellato, registrare le coordinate anteriori/posteriori e laterali del bregma.
- Livello cranio sinistra-destra
- Spostare la fresa da bregma alla coordinata (anteroposteriore [A/P]: -3,1 mm, mediolaterale [M/L]: +2,0 mm), abbassare la fresa fino al cranio e registrare la coordinata verticale. Ripetere quindi questa procedura per la coordinata (A/P: -3,1 mm, M/L: -2,0 mm).
nota: Se il cranio è livellato, queste misure verticali di due punti equidistanti dalla linea mediana sono uguali. In caso contrario, regolare l'altezza delle barre auricolari.
- Praticare con cautela un foro di fresatura in corrispondenza della coordinata target (A/P: -3,1 mm, M/L: -2,5 mm) per impiantare una cannula guida. Se il diametro di un foro di fresa non è abbastanza grande per l'impianto di una cannula guida, praticare un altro foro che si sovrapponga al primo. Praticare un altro foro sull'osso parietale destro (lato controlaterale) e inserire una vite ossea, che aiuta a fissare il cemento dentale in 1.10 (vedere la Figura 1B).
- Tagliare un pezzo di bloccaggio circolare dal lato posteriore del coperchio di una provetta da centrifuga da 1,5 ml con una lama di rasoio e fare una ''corona''. Questa corona viene utilizzata per evitare che il cemento dentale si diffonda sulla pelle. Posizionalo sul teschio in modo che i fori di bava praticati al punto 2.5 rimangano all'interno del cerchio (vedi Figura 1).
- Impostare un gruppo stereotassico inserendo una cannula guida sul braccio più corto di un adattatore stereotassico e fissarlo utilizzando un dado cieco. Posizionare il braccio più lungo dell'adattatore stereotassico sul morsetto dell'elettrodo. Fissarlo al manipolatore dell'apparato stereotassico (Vedi Figura 1A).
- Ruotare di 12 gradi il gruppo stereolitico dorso-ventrale (DV) sul braccio del manipolatore (vedere la Figura 1B). Spostare la cannula guida nel foro della fresa praticato in 1.6. Inserire lentamente la cannula guida nel cervello abbassandola di 1,2 mm.
nota: L'angolo della sonda è specifico per l'ippocampo; Altre regioni possono richiedere altri angoli o nessun angolo. Consulta un atlante cerebrale per le coordinate precise. Asciugare la superficie del cranio, perché in caso contrario il cemento non si attaccherà e il cappuccio di cemento può staccarsi
- Aggiungere il cemento dentale all'interno della corona per coprire completamente sia la parte metallica della cannula guida che la vite ossea quanto basta per fissarli. Applicare ulteriore cemento dentale se c'è una parte del cranio esposta.
- Attendere che il cemento dentale sia completamente asciutto (~12-20 min). Rimuovere l'adattatore stereotassico dal morsetto dell'elettrodo. Rimuovere il dado cieco e sostituire l'adattatore stereotassico con una sonda cieca e fissare il dado cieco.
- Liberare il topo dall'apparato stereotassico e alloggiare il topo da solo in una gabbia individuale.
nota: Il topo non deve essere lasciato incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale. Controllare il mouse ogni giorno fino al giorno della microdialisi. Il topo riceve farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS) come il carprofene se sembra soffrire. Attendere 2 settimane è necessario per gli studi sonno-veglia in modo che il topo si abitui al nuovo ambiente, ma altri tipi di studi possono richiedere periodi di recupero più brevi (ad esempio, 1-2 giorni).
3. Configurazione della microdialisi
- Controllo di qualità delle sonde: riempire una siringa monouso da 1 ml con acqua distillata e collegarla all'uscita (porta più corta) di una sonda utilizzando un tubo di byton. Coprire i fori di sfiato con le dita e premere delicatamente lo stantuffo della siringa per infondere acqua alla sonda. Verificare che l'acqua fuoriesca dall'ingresso della sonda e che non vi siano perdite sulla superficie di una membrana per microdialisi.
- Attivazione delle sonde: Immergere le membrane di una sonda in etanolo (70-100%) per due secondi. Quindi, infondere nuovamente l'acqua distillata nella sonda con una siringa.
- Preparazione del tampone di perfusione: Al fine di evitare l'adesione delle molecole bersaglio ai tubi, aggiungere BSA diluendo la soluzione di BSA al 30% al 4% con liquido cerebrospinale artificiale (aCSF: 1,3 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 3 mM KCl, 0,4 mM KH2PO4, 25 mM NaHCO3, 122 mM NaCl, pH=7,35), che corrisponde strettamente alla concentrazione di elettroliti nel liquido cerebrospinale, immediatamente prima dell'uso. Filtrare il tampone di perfusione attraverso un'unità filtrante a siringa con pori di 0,1 μm.
NOTA: L'albumina sierica bovina (BSA) al 4% migliora il recupero per le proteine aderenti, ma può limitare gravemente la somministrazione di composti, specialmente per i composti che hanno un alto legame con la BSA. Questo è uno dei vantaggi dell'utilizzo di concentrazioni più basse di BSA (come lo 0,15%) in alcuni casi. Si noti che il BSA può aggregarsi molto facilmente se agitato da un vortice o da una piastra di agitazione. Questi aggregati possono ostruire le sonde o i pori della membrana. Prestare attenzione quando si prepara una soluzione BSA per limitare questa aggregazione
- Preparare due linee separate per l'ingresso e l'uscita (vedere la Figura 1C) e collegare entrambe le linee con un ago di collegamento. Riempire una siringa monouso da 3 ml riempita con tampone di perfusione e collegarla all'estremità di ingresso del tubo utilizzando un ago smussato. Riempire l'intero tubo con un tampone di perfusione facendo funzionare la pompa a siringa.
- Arrestare la pompa a siringa e sostituire l'ago di collegamento tra la linea di ingresso e la linea di uscita con una sonda di microdialisi attivata dal passaggio 3.3 (vedere la Figura 1C). Prima di questa sostituzione, posizionare il dado cieco sulla sonda.
- Montare il tubo del rullo nel tubo di uscita della pompa a rulli. Avviare la pompa a siringa a 10 μl/min e poi la pompa a rulli alla portata leggermente più lenta (9,5-9,8 μl/min). Assicurarsi di rimuovere tutte le bolle d'aria nell'intero tubo, che potrebbero influenzare il recupero quando entrano nella sonda.
- Anestetizzare il mouse dal passaggio 1.12 allo stesso modo del passaggio 1.2. Metti il collare del mouse intorno al suo collo. Rimuovere il dado cieco e la sonda cieca e inserire lentamente una sonda per microdialisi da 3.4 attraverso la cannula guida e serrare il dado cieco.
- Posizionare il mouse nella gabbia collegata a un sistema di movimento libero e legare il mouse con il collare. Continuare a far funzionare sia la pompa a siringa che la pompa a rulli alla portata indicata al punto 3.5 per almeno 1 h.
nota: Per ottenere la raccolta ISF da animali svegli, questo articolo utilizza un sistema a movimento libero, in cui la gabbia stessa risponde al movimento di un animale per evitare che i tubi si attorciglino. In alternativa, è possibile utilizzare anche snodi liquidi disponibili da varie aziende.
- Arrestare prima la pompa a rulli e poi la pompa a siringa. Impostare la portata desiderata. Far funzionare la pompa a siringa il 20% più velocemente rispetto alla pompa a rulli.
nota: Ad esempio, se si funziona a 1 μl/min, far funzionare la pompa a siringa a 1,2 μl/min. La velocità di flusso ottimale deve essere determinata empiricamente per ogni molecola.
- Raccolta di campioni ISF: posizionare l'estremità libera del tubo di uscita sul collettore di frazioni refrigerato.
nota: Il volume del campione appropriato varia a seconda dei saggi utilizzati per l'analisi.
- Dopo il completamento dell'esperimento, rimuovere la sonda (anestetizzare il topo secondo necessità).Gestisci il ripristino del mouse allo stesso modo del passaggio 2.11. Analizza l'ISF raccolto con metodi come la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) o il saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA).
- Per lavare l'intero tubo dopo la microdialisi, collegare nuovamente i tubi di ingresso e uscita sostituendo la sonda con l'ago di collegamento e far scorrere la candeggina diluita nell'intero tubo e quindi sciacquarlo con acqua. Asciugalo e conservalo per un uso ripetuto.
nota: Altri tipi di tubi sono accettabili, tuttavia, BSA nel tampone di perfusione può ostruire i tubi di piccolo diametro, quindi questi tubi sono considerati monouso. I tubi possono essere usurati o ostruiti dopo più utilizzi, quindi assicurati che la portata sia costante ogni volta prima dell'uso.
