Modello di invasione tumorale basato su matrice utilizzando la co-coltura del glioblastoma della microglia

In questo articolo

Abstract

Fonte: Coniglio, S., et al. Saggi di cocoltura per studiare la stimolazione di macrofagi e microglia dell'invasione del glioblastoma. J. Vis. Exp. (2016)

In questo video, le cellule di glioblastoma e microglia vengono miscelate con una soluzione di matrice polimerica e trasferite in un inserto di camera porosa dove si forma un gel, che incorpora le cellule. Le microglia stimolano la migrazione delle cellule di glioblastoma attraverso l'inserto poroso, imitando l'invasione delle cellule tumorali nel tessuto circostante, le cellule vengono quindi fissate e preparate per ulteriori analisi.

Protocollo

1. Marcatura fluorescente delle cellule

NOTA: Etichettare le linee cellulari di glioblastoma e la microglia con coloranti fluorescenti 9. In alternativa, generare linee cellulari che esprimono costitutivamente proteine fluorescenti come GFP/RFP.

Piastra le celle su una piastra a 6 pozzetti in modo tale che siano confluenti al 70-80% il giorno della colorazione. Per la linea cellulare di glioblastoma murino GL261 e la linea cellulare di glioblastoma umano U87, piastra 1 x 10⁶ e 1,5 x 10⁶ cellule, rispettivamente, su una piastra di 6 cm 24 ore prima della colorazione.
Preparare una soluzione di colorante per coloranti cellulari fluorescenti in DMSO (dimetilsolfossido) e aggiungere 5 μM di colorante al terreno, sia al terreno del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) che al terreno privo di siero di macrofagi (MSFM), a vortice.
Incubare le cellule con colorante per 30 minuti a 37 °C e 5% di CO₂.
Rimuovere il colorante contenente il terreno e aggiungere il terreno fresco (RPMI o MSFM) alle cellule.
Incubare le cellule per 30 minuti. Nota: Le cellule sono ora colorate e pronte per essere utilizzate nell'esperimento.

2. Saggio di invasione "3D" che incorpora glioma e macrofagi/microglia nella matrice

Scongelare la miscela della matrice a 4 °C per una notte. Eseguire tutte le ulteriori manipolazioni utilizzando una matrice sul ghiaccio nel cofano.
Preparare una concentrazione di 10 mg/ml di matrice in terreno (MSFM o RPMI) con lo 0,3% di BSA su ghiaccio.
NOTA: La concentrazione standard della matrice è tipicamente di circa 15 mg/ml.
Per preparare le cellule (etichettate nella fase 1) per la sospensione nella matrice, rimuovere il terreno dalle cellule mediante aspirazione. Lavare le cellule su un piatto con 2 mM di EDTA (acido etilendiammina tetraacetico)/PBS (soluzione salina tamponata con fosfato). Aggiungere 500 μl di 2 mM EDTA/PBS alle cellule e incubare per 5 - 10 minuti a 37 °C e 5% di CO₂.
Risospendere le cellule in 5 ml di terreno contenente lo 0,3% di BSA.
Centrifugare per 5 minuti a 120 x g.
Aspirare il surnatante dal pellet. Risospendere il pellet in terreno/0,3% BSA in modo tale che la concentrazione di cellule sia pari a 1 x 10⁶ cellule/ml. Utilizzare un emocitometro per contare le cellule.
Aggiungere 1,5 x 10⁵ cellule GL261 (in 150 μl) + 5 x 10⁴ cellule microgliali (in 50 μl) in una provetta microfuga da 1,5 ml. Aggiungere 2 x 10⁵ celle GL261 (200 μl) in una provetta microfuge separata da 1,5 ml.
NOTA: Le cellule GL261 da sole senza microglia fungono da controllo.
Far girare le cellule in una microfuga per 5 minuti a 120 x g.
Risospendere le cellule in una matrice fredda da 200 μl su ghiaccio.
Posizionare 50.000 celle (50.000 μl) al centro dello scomparto superiore dell'inserto della camera con pori da 8 μM.
Incubare a 37 °C per 30 minuti affinché avvenga la polimerizzazione.
Aggiungere 200 μl di terreno privo di siero nella camera superiore e 700 μl di terreno di crescita cellulare contenente siero nel pozzetto inferiore.
Incubare a 37 °C, 5% CO₂ per 48 ore.
Dopo l'incubazione, rimuovere le cellule dalla parte superiore della camera mediante aspirazione delicata e fissare le camere mettendole in formaldeide al 3,7% in PBS. Lasciare che le camere rimangano in fissativo per 15 minuti a temperatura ambiente (o per una notte a 4 °C). Rimuovere il fissativo mediante aspirazione delicata e sostituirlo con 500 μl 1x PBS. Procedere alla sezione 4 per l'analisi delle immagini.

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Risultati

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Figura 1: Schema di due diversi protocolli per l'analisi dell'invasione di cellule di glioblastoma stimolata da microglia/macrofagi. Il pannello superiore illustra il saggio di invasione della camera a matrice pre-rivestita. Il pannello inferiore illustra il saggio di invasione della matrice 3D.