Infezione da virus Zika delle cellule staminali neurali fetali

Abstract

Fonte: McGrath, E. L., et al., Infezione da virus Zika di cellule staminali neurali cerebrali fetali umane in coltura per analisi immunocitochimiche. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video mostra una procedura per infettare le cellule staminali neurali fetali umane con il virus Zika. Le cellule infette possono essere utilizzate per ulteriori studi.

Protocollo

1. Infezione da virus Zika

NOTA: ZIKV è altamente sensibile alla temperatura, quindi è imperativo che le scorte ZIKV siano conservate a -80 °C e che si evitino cicli di congelamento/scongelamento. Continuate a lavorare le aliquote sul ghiaccio.

1. Celle di passaggio. Sono necessari 3-4 milioni di cellule in totale per seminare una piastra a 24 pozzetti, quindi durante il passaggio, mettere il numero di cellule necessarie per l'infezione e la semina in un pallone durante il passaggio.
2. Se si seminano le cellule in una piastra a 24 pozzetti per la colorazione, preparare la piastra [Rivestire i pozzetti contenenti vetrini coprioggetti con poli-D-lisina (PDL) allo 0,01% in acqua sterile e incubare per 1 ora a 37 °C. Per una piastra a 24 pozzetti, utilizzare 250 μL di PDL per pozzetto].
3. Dopo il passaggio, inserire 1 mL di sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e centrifugare a 200 x g a temperatura ambiente per 5 minuti. Quindi rimuovere il surnatante per aspirazione.
4. Risospendere il pellet cellulare nel brodo ZIKV per acquisire una molteplicità di infezioni (MOI) da 1 a 10. Il volume della soluzione di ZIKV non deve superare 0,5 mL. Per il trattamento simulato (celle di controllo), risospendere le cellule nello stesso volume e tipo di terreno utilizzato nello stock ZIKV.
5. Incubare sopra la miscela di cellule/ZIKV a 37 °C per 1 ora. Capovolgere la provetta 2-3 volte, quindi centrifugare la miscela per 5 minuti a 216 x g a temperatura ambiente per ottenere un pellet di cellule. Risospendere il pellet in dPBS e centrifugare nuovamente per 5 minuti a 216 x g a temperatura ambiente.
6. Rimuovere il surnatante per aspirazione, risospendere le cellule con un terreno appropriato e caricare le cellule infette in un pallone o in una piastra necessari per l'esperimento. Se si seminano le cellule in una piastra a 24 pozzetti, risospendere il pellet in 12 mL di terreno appropriato, quindi aggiungere 500 μL di sospensione a ciascun pozzetto.
   NOTA: A questo punto o mantieni le cellule nei mezzi di crescita per osservare gli effetti di ZIKV sulle cellule staminali, oppure vai ai passaggi 6 o 7 per studiare l'effetto di ZIKV sul processo di differenziazione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM	Gibco	11965-092
F12	Gibco	11765-054
Glucosio (10%)	Sigma	G8644
HEPES (1M)	Corning/cellgro	25-060-c1
Penna Strep (100x)	Gibco	15140-122
Incubatore ad anidride carbonica	Thermo Forma	Modello# 3110
Centrifuga	Thermo fisher Scientific	75004221
Cabina di sicurezza biologica	Forma scientific Claas II A/B3	Modello# 1284
Poliferamide di D-lisina(PDL)	Sigma	P6407-5MG
Laminina	Invitrogen	23017-015