Stimolazione dei neuroni sensoriali del ganglio della radice dorsale utilizzando un agonista del recettore dei neuropeptidi

Abstract

Fonte: Lin, Y., et al., Isolamento dei gangli della radice dorsale e coltura primaria per studiare il rilascio di neurotrasmettitori. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video dimostra l'uso di cellule gangliari della radice dorsale trasfettate per studiare il rilascio di neurotrasmettitori stimolandole con un agonista del recettore dei neuropeptidi.

Protocollo

1. Rilascio di neurotrasmettitori da cellule DRG primarie

1. Il giorno 6, dopo che le cellule sono state piastrate (72 ore dopo la trasfezione del siRNA), cambiare il terreno di coltura in 200 μL di terreno privo di siero e incubare le cellule in un incubatore a 37 °C di CO₂ per 30 minuti.
2. Aggiungere 1 μL di sostanze chimiche di stimolazione e mescolare delicatamente il terreno mediante pipettaggio. Incubare la capsula in un'incubatrice a 37 °C di CO₂ per il tempo stabilito.
   nota: In questo articolo, le cellule coltivate sono state stimolate con l'agonista NPFFR2, dNPA (D.Asn-Pro-(N-Me)Ala-Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg- Phe-NH2, 5 nmol), per 1 ora.
3. Raccogliere il terreno di coltura dalla piastra di coltura e centrifugare a 5.000 x g per 5 minuti a 4 °C per rimuovere eventuali impurità in sospensione.
4. Raccogliere il surnatante dalla centrifugazione e diluire i campioni con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) secondo necessità. Quindi, utilizzare i kit di immunodosaggio enzimatico (EIA) per dosare i livelli di neurotrasmettitori.
   nota: Qui, i surnatanti sono stati diluiti 1:100 prima di analizzare il livello di CGRP. Il surnatante non è stato diluito prima di analizzare il livello di SP.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM-F12	Invitrogen	12400024	Terreno di coltura
Soluzione salina bilanciata di Hank	Invitrogen	14170-112	Terreno di coltura
Pipetta Pasteur	Hilgenberg	3150102	Triturazione cellulare
dNPA	Sintesi Genemed	N/A	Agonista NPFFR2