Studio della trasmigrazione dei linfociti attraverso un monostrato di cellule endoteliali microvascolari

Abstract

Fonte: Schulte-Mecklenbeck, A., et al., Analisi dello stravaso dei linfociti utilizzando un modello in vitro della barriera emato-encefalica umana. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video mostra un'indagine sperimentale sulla trasmigrazione dei linfociti attraverso un modello di endotelio della barriera emato-encefalica (BBB). Un monostrato di cellule endoteliali microvascolari cerebrali umane (HBMEC) viene generato in vitro e al monostrato vengono aggiunte cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) contenenti linfociti. Le cellule vengono quindi incubate per consentire la trasmigrazione dei linfociti e le cellule migrate vengono quantificate utilizzando la citometria a flusso.

Protocollo

1. Preparazione degli inserti per colture cellulari

1. Rivestimento di inserti per colture cellulari
   Nota importante: Evitare di toccare la membrana degli inserti per colture cellulari.
   1. Aggiungere 100 μL di soluzione di fibronectina a ciascun inserto di coltura cellulare (Figura 1A) e un pozzetto di una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti (pozzetto di controllo ottico). Incubare per almeno 3 ore a 37 °C. Dopo l'incubazione, aspirare la soluzione di fibronectina.
   2. Aggiungere 100 μl di sospensione HBMEC agli inserti per colture cellulari e al pozzetto di controllo ottico. Aggiungere 600 μl di terreno di coltura endoteliale medio-basale (ECM-b) al compartimento inferiore degli inserti di coltura cellulare. Incubare per 3 - 4 giorni a 37 °C / 5% CO₂ fino al raggiungimento dell'integrità della barriera (Figura 1B), controllare la crescita cellulare mediante valutazione microscopica dell'HBMEC nel pozzetto di controllo ottico.
      nota: La crescita cellulare oltre i quattro giorni non è raccomandata.

2. Saggio di migrazione

1. Preparazione di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC).
   1. Aggiungere 10 ml di terreno del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) in una provetta da centrifuga da 15 ml e aggiungere 200 μl di integratore di B27. Contare le PBMC e centrifugare le celle a 300 x g per 5 minuti. Risospendere la PBMC a una concentrazione finale di 5 x 10⁶ cellule/mL RPMI/B27.
2. Impostazione del saggio di migrazione
   1. Aspirare il terreno dal compartimento inferiore seguito dal compartimento superiore degli inserti per colture cellulari contenenti monostrati HBMEC confluenti (Figura 1A). Per ogni donatore, aggiungere 100 μL di sospensione di PBMC agli inserti di coltura cellulare e anche a un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti per (controllo in vitro).
   2. Aggiungere 600 μL di RPMI/B27 al compartimento inferiore degli inserti di coltura cellulare e 500 μL al PBMC del controllo in vitro e incubare 6 ore a 37 °C / 5% CO_2.
3. Raccolta delle PBMC migrate
   1. Estrarre l'inserto per colture cellulari utilizzando una pinza e sciacquare accuratamente il fondo con 400 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) senza toccare la membrana. Eliminare l'inserto per coltura cellulare.
   2. Aggiungere 20 μL di fluorosfere per il conteggio del flusso (circa 1.000 sfere/μL) al compartimento inferiore dell'inserto di coltura cellulare e al controllo in vitro e mescolare bene. Trasferire 1 mL della sospensione di PBMC risultante nelle provette per citometria a flusso.

3. Citometria a flusso

1. Preparazione del campione
   1. Centrifugare PBMC a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente.
   2. Preparare la soluzione anticorpale aggiungendo anticorpi coniugati con fluorocromo a 100 μL di tampone per citometria a flusso (PBS/1% albumina sierica bovina [BSA]/2 mM di acido etilendiamminotetraacetico [EDTA]) per campione. Per i risultati presentati di seguito, per campione sono stati utilizzati 1 μL di CD4-FITC (cluster di differenziazione 4-fluoresceina isotiocianato), 1 μL di CD3-PerCP/Cy5.5 (proteina peridina clorofilla/cianina 5. 5), 1 μL di CD56-PC7 (ficoeritrina cianina 7), 1 μL di CD8-A700 (Alexa fluor 700) e 1 μL di CD16-A750 (Alexa fluor 750).
   3. Risospendere la PBMC in 100 μL della soluzione anticorpale e incubare per 30 minuti a 4 °C.
   4. Aggiungere 250 μL di tampone per citometria a flusso e centrifugare a 300 x g per 5 minuti.

Risultati

Figura 1: Migrazione differenziale di sottogruppi di cellule NK attraverso monostrati HBMEC non infiammati e infiammati.Un'immagine degli inserti dei transwell (a sinistra) e l'illustrazione della configurazione sperimentale (a destra). B. Validazione delle funzioni di barriera HBMEC. A sinistra: colorazione immunoistochimica della molecola a giunzione stretta ZO-1 utilizzando zonula...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
PBS	Gibco	14190-094	senza CaCl2 o MgCl2
Fibronectina 1mg/mL	Sigma	F1141-5MG	dal plasma bovino
HBMEC	ScienCell	1000
HBMEC	Pelobiotech	PB-H-6023
ECM-b	ScienCell	1001-b
FBS	ScienCell	1001-b
Penicillina/Streptomicina	ScienCell	1001-b
Integratore per la crescita delle cellule endoteliali	ScienCell	1001-b
Transwell	Corning	3472	trasparente, diametro 6,5 mm, dimensione dei pori 3,0 μm
Piastra a fondo piatto a 96 pozzetti	Corning	3596
B27	Gibco	17504-044	50x concentrato
Piastra a 48 pozzetti	Corning	3526
Numero di giri 1640	Gibco	61870-010
Fluorazioni di flusso	Beckman Coulter	7547053
Na-EDTA	Sigma	E5134
BSA	Sigma	A2153
CD3-PerCP/Cy5.5	Bioleggenda	300430	clone UCHT1
CD56-PC7	Beckman Coulter	A21692	clone N901
CD16-A750	Beckman Coulter	A66330	clone 3G8
CD4-FITC	Bioleggenda	300506	clone RPA-T4
CD8-A700	Beckman Coulter	A66332	clone B9.11