Studio della trasmigrazione dei linfociti attraverso un monostrato di cellule endoteliali microvascolari

In questo articolo

Abstract

Fonte: Schulte-Mecklenbeck, A., et al., Analisi dello stravaso dei linfociti utilizzando un modello in vitro della barriera emato-encefalica umana. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video mostra un'indagine sperimentale sulla trasmigrazione dei linfociti attraverso un modello di endotelio della barriera emato-encefalica (BBB). Un monostrato di cellule endoteliali microvascolari cerebrali umane (HBMEC) viene generato in vitro e al monostrato vengono aggiunte cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) contenenti linfociti. Le cellule vengono quindi incubate per consentire la trasmigrazione dei linfociti e le cellule migrate vengono quantificate utilizzando la citometria a flusso.

Protocollo

1. Preparazione degli inserti per colture cellulari

Rivestimento di inserti per colture cellulari
Nota importante: Evitare di toccare la membrana degli inserti per colture cellulari.
1. Aggiungere 100 μL di soluzione di fibronectina a ciascun inserto di coltura cellulare (Figura 1A) e un pozzetto di una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti (pozzetto di controllo ottico). Incubare per almeno 3 ore a 37 °C. Dopo l'incubazione, aspirare la soluzione di fibronectina.
2. Aggiungere 100 μl di sospensione HBMEC agli inserti per colture cellulari e al pozzetto di controllo ottico. Aggiungere 600 μl di terreno di coltura endoteliale medio-basale (ECM-b) al compartimento inferiore degli inserti di coltura cellulare. Incubare per 3 - 4 giorni a 37 °C / 5% CO₂ fino al raggiungimento dell'integrità della barriera (Figura 1B), controllare la crescita cellulare mediante valutazione microscopica dell'HBMEC nel pozzetto di controllo ottico.
  nota: La crescita cellulare oltre i quattro giorni non è raccomandata.

2. Saggio di migrazione

Preparazione di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC).
1. Aggiungere 10 ml di terreno del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) in una provetta da centrifuga da 15 ml e aggiungere 200 μl di integratore di B27. Contare le PBMC e centrifugare le celle a 300 x g per 5 minuti. Risospendere la PBMC a una concentrazione finale di 5 x 10⁶ cellule/mL RPMI/B27.
Impostazione del saggio di migrazione
1. Aspirare il terreno dal compartimento inferiore seguito dal compartimento superiore degli inserti per colture cellulari contenenti monostrati HBMEC confluenti (Figura 1A). Per ogni donatore, aggiungere 100 μL di sospensione di PBMC agli inserti di coltura cellulare e anche a un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti per (controllo in vitro).
2. Aggiungere 600 μL di RPMI/B27 al compartimento inferiore degli inserti di coltura cellulare e 500 μL al PBMC del controllo in vitro e incubare 6 ore a 37 °C / 5% CO_2.
Raccolta delle PBMC migrate
1. Estrarre l'inserto per colture cellulari utilizzando una pinza e sciacquare accuratamente il fondo con 400 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) senza toccare la membrana. Eliminare l'inserto per coltura cellulare.
2. Aggiungere 20 μL di fluorosfere per il conteggio del flusso (circa 1.000 sfere/μL) al compartimento inferiore dell'inserto di coltura cellulare e al controllo in vitro e mescolare bene. Trasferire 1 mL della sospensione di PBMC risultante nelle provette per citometria a flusso.

3. Citometria a flusso

Preparazione del campione
1. Centrifugare PBMC a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente.
2. Preparare la soluzione anticorpale aggiungendo anticorpi coniugati con fluorocromo a 100 μL di tampone per citometria a flusso (PBS/1% albumina sierica bovina [BSA]/2 mM di acido etilendiamminotetraacetico [EDTA]) per campione. Per i risultati presentati di seguito, per campione sono stati utilizzati 1 μL di CD4-FITC (cluster di differenziazione 4-fluoresceina isotiocianato), 1 μL di CD3-PerCP/Cy5.5 (proteina peridina clorofilla/cianina 5. 5), 1 μL di CD56-PC7 (ficoeritrina cianina 7), 1 μL di CD8-A700 (Alexa fluor 700) e 1 μL di CD16-A750 (Alexa fluor 750).
3. Risospendere la PBMC in 100 μL della soluzione anticorpale e incubare per 30 minuti a 4 °C.
4. Aggiungere 250 μL di tampone per citometria a flusso e centrifugare a 300 x g per 5 minuti.

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Risultati

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Figura 1: Migrazione differenziale di sottogruppi di cellule NK attraverso monostrati HBMEC non infiammati e infiammati.Un'immagine degli inserti dei transwell (a sinistra) e l'illustrazione della configurazione sperimentale (a destra). B. Validazione delle funzioni di barriera HBMEC. A sinistra: colorazione immunoistochimica della molecola a giunzione stretta ZO-1 utilizzando zonula...