Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Determinazione della zona di infarto
- Misurare la zona dell'infarto (IZ) a 24 ore dopo l'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO).
NOTA: I ratti che hanno perso più del 20% del loro peso o hanno sviluppato convulsioni o emiplegia sono esclusi dall'esperimento.
- Eutanasia del ratto sostituendo la miscela di gas inspirato con il 20% di ossigeno e l'80% di anidride carbonica fino a quando il ratto non smette di respirare spontaneamente.
- Aprire il torace con un'incisione laterale di 5-6 cm attraverso la parete addominale sotto la gabbia toracica utilizzando forbici e pinze chirurgiche.
- Eseguire un'incisione diaframmatica lungo l'intera lunghezza della gabbia toracica con forbici e pinze chirurgiche.
- Spostando con cautela i polmoni, tagliare la gabbia toracica fino alla clavicola sui lati destro e sinistro.
- Perfondere con 200 mL di soluzione fisiologica attraverso il ventricolo sinistro del cuore.
- Pungere o incidere l'atrio destro del cuore con le forbici.
- Esegui la decapitazione usando una ghigliottina e raccogli il tessuto cerebrale.
- Usando le forbici dell'iride, tagliare dal forame magno al bordo distale della superficie posteriore del cranio su entrambi i lati.
- Separare i bulbi olfattivi, le connessioni nervose lungo la superficie ventrale e la superficie dorsale del cranio dal cervello.
- Rimuovi il cervello dalla testa.
- Produci 6 fette di cervello creando sezioni orizzontali spesse 2 mm con una lama di rasoio a filo singolo in acciaio inossidabile da .009", non rivestita.
- Incubare per 30 minuti a 37 °C in TTC allo 0,05%.
- Posizionare il tessuto cerebrale sui vetrini del microscopio ed eseguire la scansione ottica di queste 6 fette di cervello con una risoluzione di 1600x1600 dpi (vedi Figura 1 per esempio).
- Aggiungi un filtro blu con un editor di foto (ad esempio, Adobe Photoshop CS2) utilizzando la funzione Mixer canali ( Regolazioni > immagini > Mixer canali) e salva l'immagine in formato file JPEG.
NOTA: Dopo aver applicato il filtro blu, l'immagine apparirà in scala di grigi.
- Aprire l'immagine salvata in ImageJ 1.37v.
NOTA: Questo programma per computer utilizza una funzione di soglia per isolare e calcolare i pixel che sono neri o bianchi (vedi Figura 2).
- Per ciascuna delle 6 fette cerebrali dell'immagine, selezionare e salvare ogni emisfero (ipsilaterale sinistro ferito e controlaterale sinistro illeso) come file immagine separato utilizzando lo strumento "selezione poligono" dal menu principale.
- Impostare il limite per la determinazione dell'IZ utilizzando una funzione di soglia automatica dal menu principale del software ImageJ selezionando Immagine > Regola > soglia e misurare il numero di pixel in ciascun emisfero di un singolo set di cervelli.
NOTA: Le macro possono essere utilizzate per questo passaggio nel software ImageJ (vedere Documento supplementare 1 per il codice). Il taglio è un parametro critico per determinare quali pixel convertire in bianco e quali convertire in nero, a seconda della tonalità di grigio (vedi Figura 3 e Figura 4 come esempi). ImageJ confronta quindi i pixel bianchi e neri per determinare IZ. Sulla base del protocollo di colorazione e delle impostazioni dello scanner, abbiamo utilizzato un valore di cut-off costante di 0,220.
- Eseguire la misurazione della correzione dell'IZ per il rigonfiamento dei tessuti utilizzando il metodo RICH (Ratios of Ipsilateral and Contralateral Cerebral Hemispheres) (vedere l'esempio in Figura 5).
NOTA: La dimensione dell'infarto è valutata come percentuale dell'emisfero controlaterale.
2. Determinazione dell'edema cerebrale
NOTA: Utilizzare ImageJ 1.37v per la misurazione dell'edema cerebrale (BE).
- Misurare BE 24 ore dopo MCAO. Per il calcolo di BE, utilizzare i dati del volume dell'emisfero sinistro e destro (in unità).
- Eseguire la scansione ottica con una risoluzione di 1600x1600 dpi (vedere ad esempio Figura 1).
- Selezionare gli emisferi cerebrali e impostare il cut-off per la determinazione del BE con ImageJ 1.37v, come descritto sopra nelle sezioni 1.17-1.19.
- Esprimere l'area BE come percentuale delle aree standard dell'emisfero controlaterale non interessato, calcolate con il metodo RICH utilizzando la seguente equazione (vedere l'esempio in Figura 5).
NOTA: L'estensione del BE è valutata come percentuale dell'emisfero controlaterale.
