Valutazione della resistenza elettrica transendoteliale in un modello di barriera emato-encefalica in vitro

Abstract

Fonte: Kuzmanov, I., et al. Un modello in vitro della barriera emato-encefalica utilizzando la spettroscopia di impedenza: un focus sull'interazione tra cellule T e cellule endoteliali. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video mostra un metodo per valutare la resistenza elettrica transendoteliale (TEER) nelle cellule endoteliali microvascolari cerebrali di topo in vitro. Un valore TEER elevato indica giunzioni di cellule endoteliali intatte, mentre l'aggiunta di cellule T attivate abbassa il valore TEER, riflettendo la rottura della barriera giunzionale.

Protocollo

1. Impostazione ed esecuzione della misurazione della resistenza elettrica transendoteliale (TEER)

1. Posizionare il modulo a 24 pozzetti dello strumento di resistenza elettrica transendoteliale (TEER) sotto la cappa a flusso laminare. Rimuovere i coperchi e posizionare gli inserti con le cellule endoteliali microvascolari primarie del cervello di topo (MBMEC) nello strumento utilizzando una pinza.
2. Pipettare 810 μl di terreno fresco nello scomparto inferiore dei pozzetti del modulo: aggiungerlo con cautela tra l'inserto e la parete del pozzetto del modulo.
3. Chiudere i coperchi e posizionare lo strumento nell'incubatrice. Collegare lo strumento al suo computer; Accendere il controller dello strumento e aprire il software.
4. Seleziona "nuova misurazione" nella finestra pop-up. Seleziona le caselle 'mostra TEER' e 'mostra Ccl'; quindi premere "Avvia". Dopo aver completato la prima misurazione, selezionare "controlla tutti i pozzetti" nella scheda "risultati" per visualizzare tutti i valori di TEER e capacità dello strato di celle (Ccl).
5. Salva il file: File>Salva con nome> il nome del tuo file".
   NOTA: Poiché TEER e Ccl vengono misurati continuamente in modo automatizzato, monitora i loro valori per un periodo da tre a cinque giorni. La sostituzione del terreno non è necessaria a meno che la vitalità cellulare non sia subottimale, come dimostrato dalla mancanza di aumento del TEER.
6. Scegliere il momento in cui co-coltivare MBMEC con cellule T quando Ccl è stabile e inferiore a 1 μF/cm² e TEER ha raggiunto il suo livello massimo.
7. Ispezionare attentamente i valori assoluti di TEER e Ccl ed escludere i pozzi in cui gli MBMEC non hanno sviluppato abbastanza monostrati confluenti deselezionando tali pozzetti.
8. Raggruppa il resto dei pozzetti: fai clic con il pulsante destro del mouse su un pozzo e seleziona "aggiungi pozzo a un nuovo pozzo medio". Assegnagli un nome nella finestra pop-up; Fai lo stesso per tutti i singoli pozzetti da raggruppare.
9. Controlla tutti i pozzetti medi per confermare che tutti abbiano le stesse condizioni iniziali prima della co-coltura. Se alcuni di essi hanno valori assoluti TEER o pendenze TEER significativamente diversi o se gli errori standard sono troppo grandi, ripetere il raggruppamento.
   NOTA: Il raggruppamento ottimale dei pozzetti fornisce una variazione minima nei valori TEER all'interno e tra i gruppi sperimentali.
10. Nella scheda "esperimento", premere "pausa", scollegare lo strumento ed estrarlo dall'incubatrice. Rimuovere i coperchi sotto la cappa a flusso laminare.
11. Preparare cellule T pre-attivate e/o naïve, con o senza citochine specifiche, anticorpi o altre sostanze, a seconda delle esigenze. Ad esempio, miscelare l'anticorpo purificato anti-interferone-gamma di topo (IFN-γ) nativo/a basso contenuto di endotossine (NA/LE) di ratto (clone XGM1.2) con cellule T preparate a 20 μg/ml per pozzetto dello strumento TEER.
    NOTA: Se vengono utilizzate sostanze come l'inibitore del granzima B, queste vengono aggiunte alla coltura di cellule T all'inizio della stimolazione delle cellule T: ad esempio, l'inibitore del granzima B II (Calbiochem) viene miscelato con cellule T isolate a una concentrazione finale di 10 μM in dimetilsolfossido (DMSO).
12. Rimuovere parte del supporto dall'inserto (lo scomparto superiore del pozzetto). Esempio: pipettare con cura 150 μl (evitare di rimuovere tutto il terreno in quanto potrebbe disturbare il monostrato MBMEC).
13. Aggiungere le cellule T agli MBMEC pipettando accuratamente 150 μl di terreno contenente 2 x 10⁵ cellule/inserto.
    NOTA: Quando si raccolgono cellule T pre-attivate, contare solo le cellule prive di Trypan Blue.
14. Chiudere i coperchi e riposizionare lo strumento nell'incubatrice. Ricollegare lo strumento e premere 'riprendi misurazione'. Dopo 24 ore, premere "stop" nella scheda "esperimento" e salvare il file (File>Save).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
cellZscope	nanoAnalytics GmbH	www.nanoanalytics.com	incluso: Modulo cella a 24 pozzetti, Controller, PC con software cellZscope v2.2.2
Inserti a membrana Transwell - dimensione dei pori 0,4 μm	Corning	3470	per la misurazione TEER come lettura principale
Inserti a membrana Transwell - dimensione dei pori 3 μm	Corning	3472	per la misurazione TEER come controllo di qualità prima del test di trasmigrazione delle cellule T
Piastra per colture cellulari a 24 pozzetti	Greiner	650 180	fondo piatto; per la cultura MBMEC
Piastra per colture cellulari a 96 pozzetti	Costar	3526	fondo rotondo; per coltura di cellule immunitarie
Camera di conteggio Neubauer	Marienfeld	MF-0640010	per il conteggio delle celle
Collagene di tipo IV da placenta umana	Sigma	C5533	per la soluzione di rivestimento MBMEC
Fibronectina da plasma bovino	Sigma	F1141-5MG	per la soluzione di rivestimento MBMEC
DMEM (+ GlutaMAX)	Gibco	31966-021	per l'isolamento MBMEC e il terreno di coltura MBMEC
Penicillina/Streptomicina	Sigma	P4333	per l'isolamento MBMEC e il terreno di coltura MBMEC
Eparina	Sigma	H3393	per il terreno di coltura MBMEC
Fattore di crescita dei fibroblasti basici umani (bFGF)	PeproTech	100-18B	per il terreno di coltura MBMEC
IMDM + 1% L-glutammina	Gibco	21980-032	per il terreno di coltura delle cellule T
IFN-γ murino ricombinante	PeproTech	315-05	per i saggi di trasmigrazione delle cellule T
TNF-α murino ricombinante	PeproTech	315-01A	per i saggi di trasmigrazione delle cellule T
Anticorpo anti-IFN-γ di topo purificato NA/LE	BD Bioscienze	554408	clone XMG1.2; Concentrazione finale consigliata: 20 μg/ml
Inibitore del Granzima B II	Calbiochem	368055	concentrazione finale consigliata: 10 μM
Anticorpo CD4 anti-topo PE	Bioleggenda	116005	clone RM4-4; per l'analisi della trasmigrazione delle cellule T
Soluzione di Trypan Blue, 0,4%	Thermo Fisher Scientific	15250061	per il conteggio delle celle