Colorazione immunoistochimica delle fibre nervose nel nucleo basale di Meyner del cervello di topo

Abstract

Fonte: Singh, P., et al. Stima stereologica della lunghezza delle fibre colinergiche nel nucleo basale di Meynert del cervello di topo. J. Vis. Exp. (2020)

Questo video dimostra la colorazione immunoistochimica delle fibre colinergiche nel nucleo basale della regione di Meynert delle sezioni cerebrali di topo. Le sezioni vengono bloccate e trattate con anticorpi primari contro la colina acetiltransferasi, seguiti da anticorpi secondari biotinilati. Vengono aggiunti complessi avidina-biotina-perossidasi, che si legano agli anticorpi secondari, seguiti dal substrato cromogenico. Le sezioni vengono quindi disidratate e montate prima di essere visualizzate al microscopio.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Perfusione e lavorazione dei tessuti

1. Anestetizzare i topi utilizzando un'iniezione intraperitoneale con ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). Pizzica le dita dei piedi per confermare la mancanza di risposta prima di continuare.
2. Perfondere per via transcardica con ~50 mL di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) ghiacciata 0,1M seguita da paraformaldeide (PFA) al 4% in tampone fosfato 0,1M (PB).
   ATTENZIONE: Il PFA è tossico. Utilizzare dispositivi di protezione individuale (DPI) quando si lavora con PFA.
3. Rimuovere le cervelle e immergerle in PFA al 4% in 0,1 M PB a 4 °C per 24 ore per la post-fissazione. Lavare con DPBS 3x.
4. Passare a una soluzione di saccarosio al 15% in 0,1 DPBS per una notte e poi a una soluzione di saccarosio al 30% in 0,1 M DPBS per altre 48 ore a 4 °C.
5. Rimuovere il tessuto dalla soluzione di saccarosio e congelarlo in una camera criotomica preimpostata a una temperatura di -20 °C. I campioni congelati possono essere conservati in provette sigillate a -80 °C fino al sezionamento.
6. Incorporare i tessuti in un terreno di inclusione alla temperatura di taglio ottimale (vedi Tabella dei materiali) e montati su un disco per campioni. Tagliare sezioni seriali di 30 μm di spessore su un piano coronale utilizzando un criotomo e raccogliere tutte le sezioni di conseguenza in piastre di coltura a 24 pozzetti riempite con soluzione crioprotettiva (30% glicerolo, 30% glicole etilenico, 40% DPBS; Figura 1A-C). Conservare in congelatore a -20 °C.
   NOTA: Le sezioni più spesse (ad es. 50 μm) sono preferibili quando possibile. Assicurarsi che le sezioni siano mantenute in ordine di taglio e che tutte le sezioni siano completamente in crioprotettore. Una piastra a 96 pozzetti può essere utilizzata in alternativa alle piastre a 24 pozzetti per raccogliere le sezioni.
7. Coprire i pozzetti con un sigillante per piastre per evitare l'evaporazione e l'essiccazione. Conservare le piastre a -20 °C fino a nuovo utilizzo. Le sezioni conservate a -20 °C sono stabili per diversi mesi per l'immunoistochimica della colina acetiltransferasi (ChAT).

2. Selezione sistematica delle sezioni per IHC

NOTA: Dovrebbe essere fatto uno studio pilota per conoscere il numero totale di sezioni necessarie per raggiungere un coefficiente di errore (CE) accettabile. Il valore CE è un'espressione della quantità totale di errore nella procedura di campionamento. Il valore più basso rappresenta l'errore minimo e un valore CE inferiore a 0,1 è considerato accettabile dal software utilizzato qui (vedi Tabella dei materiali).

1. Identificare la prima e l'ultima sezione per ogni cervello confrontando le caratteristiche morfologiche con un atlante cerebrale di topo standard come Franklin e Paxinos. Il nucleo basale di Meynert o NBM inizia a -0,0 mm e termina a -1,6 mm. Pertanto, circa 50 sezioni contengono NBM. Il numero totale di sezioni è uno dei parametri richiesti durante la stereologia. La selezione di ogni 8a sezione (SSF = 1/8) ha fornito un totale di 6-7 sezioni per l'analisi e ha prodotto un CE accettabile sia per la stima del volume che per la stima della lunghezza delle fibre nel nostro studio pilota.
2. Iniziare in modo casuale con una delle prime otto sezioni e quindi campionare sistematicamente ogni 8a sezione fino all'ultima sezione posteriore contenente NBM (Figura 1C).

3. Immunoistochimica

1. Trasferire le sezioni crioconservate a temperatura ambiente in crioprotettore e poi tampone fosfato (PB) 0,1M in piastre a 6 pozzetti.
2. Lavare 3 volte in PB.
3. Incubare in 0,3% H₂O₂ in metanolo per 15 min.
4. Lavare 3 volte in soluzione salina tamponata con Tris (TBS).
5. Incubare in Triton X-100 allo 0,25% in TBS per 30 min.
6. Bloccare con il 10% di siero bovino normale (NBS) in Triton X-100 allo 0,1% in TBS per 30 minuti.
7. Incubare con una diluizione 1:1.000 di anticorpi primari ChAT umani di capra (vedere la Tabella dei materiali) in TBS con Triton X-100 allo 0,1% e NBS all'1% per 48 ore a 4 °C.
8. Lavare 3 volte in TBS a temperatura ambiente. Eseguire tutte le ulteriori incubazioni e lavaggi a temperatura ambiente.
9. Incubare con anticorpo secondario biotinilato bovino anti-capra (vedere la Tabella dei Materiali) per 1 ora.
10. Lavare 3 volte in TBS.
11. Incubare con il complesso avidina-biotina-perossidasi (vedi Tabella dei materiali).
12. Lavare 3 volte in TBS.
13. Sviluppare utilizzando una soluzione di substrato di perossidasi DAB potenziata (vedere la tabella dei materiali) secondo le raccomandazioni del produttore.
    ATTENZIONE: Il DAB è un sospetto cancerogeno. È tossico per contatto e inalazione. Utilizzare i DPI quando si lavora con DAB.
14. Lavare la sezione un paio di volte con acqua distillata e mantenere in Tris pH = 7,6.
15. Montare le sezioni sui vetrini gelatinizzati. Tutte le sezioni di un tessuto possono essere posizionate sullo stesso vetrino. Asciugare le sezioni all'aria, disidratarle 2 volte per 5 minuti ciascuna con etanolo al 70%, 90%, 95% e 100%, quindi eliminare le sezioni con due lavaggi di xilene da 10 minuti. Far scivolare le sezioni utilizzando un supporto di montaggio (vedi Tabella dei materiali).
    NOTA: Il tempo di lavorazione della disidratazione e della schiaritura influisce sullo spessore delle sezioni. Pertanto, le stesse condizioni dovrebbero essere utilizzate per tutte le sezioni. Nel presente studio, il valore medio per lo spessore finale era di 21,11 ± 0,45 μm.
16. Tenere ad asciugare le sezioni della cappa aspirante. Le sezioni asciutte sono pronte per la stereologia.

Risultati

Figura 1: Illustrazione del trattamento e del campionamento dei tessuti utilizzati nel presente studio. Preparazione e campionamento dei campioni. (A) Il cervelletto e il bulbo olfattivo vengono rimossi prima di essere montati sul disco del campione. (B) Orientamento del cervello sul disco del campione per il taglio della sezione. Un'incisione longitudinale poco profonda (contrassegnata da una linea)...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit ABC	Laboratori Vettoriali	PK6100
Anticorpo anti-ChAT	Millipore, MA, Stati Uniti	AB144P
IgG-B anti-capra bovina	Santacruz Biotecnologia	SC-2347
Siero bovino, adulto	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti d'America	B9433
Criostato	Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, Stati Uniti
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti	D5652
Glicole etilenico	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti	324558
Glicerolo	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti	G2025
Perossido di idrogeno	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti	H1009
Kit Immpact-DAB	Laboratori Vettoriali	SK4105	Soluzione potenziata di substrato DAB perossidasi
Ketamina	Westward Pharmaceuticals, NJ, Stati Uniti	0143-9509-01
Microscopio	Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, Stati Uniti	AF6000	Dotato di tavolino motorizzato e fotocamera digitale a colori IMI-tech
Temperatura di taglio ottimale (O.C.T.) mezzo di inclusione	Scienze della microscopia elettronica, PA, USA	62550-12
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti d'America	P6148
Supporto di montaggio permount	Scienze della microscopia elettronica, PA, USA	17986-01
Tritone X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti	T8787
Trizma Base	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti	T1503	Tris base
Trizma cloridrato	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati Uniti	T5941	Tris cloridrato
Xilazina	Bayer, Leverkusen, Germania	Rompun
Xileni, grado istologico	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	534056