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1. Assorbimento sinaptosomico della dopamina
NOTA: Questo protocollo è per la valutazione parallela di due cervelli, ma può anche essere utilizzato con successo per eseguire esperimenti di captazione sinaptosomiale della dopamina (DA) con quattro cervelli in parallelo.
- Preparazioni
- Etichettare 48 provette per microcentrifuga da 1,5 mL secondo la Tabella 1 (24 per ogni cervello). Utilizzare colori diversi per le provette appartenenti a ciascun cervello per evitare confusione tra i campioni.
- Etichettare 51 tubi di scintillazione #1-51.
- Mettere la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) sul ghiaccio. Questo servirà a mantenere il cervello freddo.
- Accendere la centrifuga per farla preraffreddare a 4 °C.
- Pre-pesare due provette da microcentrifuga per ottenere l'esatto peso del tessuto durante la preparazione sinaptosomiale (sezione 2.6).
- Preparare il tampone di omogeneizzazione mescolando 4 mM di HEPES e 0,32 M di saccarosio. Regolare il pH a 7,4 e mantenere il ghiaccio.
nota: Il tampone di omogeneizzazione può essere conservato in aliquote a -20 °C e scongelato il giorno dell'esperimento.
- Preparare il tampone di captazione combinando i seguenti elementi: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 1 mM di acido ascorbico (0,194 g/L), 5 mM di D-glucosio (0,991 g/L). Regolare il pH a 7,4 con NaOH (porta a una concentrazione di sodio di circa 130 mM) e mantenere in ghiaccio.
nota: Per 2 cervelli, preparare 1500 ml di tampone di assorbimento. Preparare il tampone di assorbimento come soluzione madre 10x senza acido ascorbico e glucosio mantenuto a 4 °C. Preparare 1x soluzione di lavoro fresca il giorno stesso, integrando con acido ascorbico e glucosio. Regolare il pH con NaOH a 7,4.
- Preparare il tampone di captazione + ligando combinando quanto segue: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 1 mM acido ascorbico (0,194 g/L), 5 mM D-glucosio (0,991 g/L), 1 μM pargylina, 100 nM desipramina, 10 nM Inibitore della catecolol-O-metil-transferasi (COMT). Regolare a pH 7,4 con NaOH e mantenere in ghiaccio.
nota: Utilizzare 50 ml di tampone di captazione e aggiungere il ligando. La pargilina viene aggiunta per aiutare a prevenire la degradazione del DA per ossidazione attraverso la monoamino ossidasi (MAO). L'inibitore delle COMT (RO-41-0960) viene aggiunto per prevenire la degradazione delle DA (catecolamine in generale) attraverso le COMT. La desipramina viene aggiunta per inibire l'assorbimento attraverso i trasportatori della noradrenalina e della serotonina, e quindi rendere i risultati dell'assorbimento specifici per il trasportatore della dopamina (DAT).
- Preparare tampone di captazione + ligando + cocaina (coc) combinando quanto segue: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 1 mM acido ascorbico (0,194 g/L), 5 mM D-glucosio (0,991 g/L), 1 μM pargilina, 100 nM desipramina, 10 nM inibitore COMT, 500 μM cocaina. Regolare il pH a 7,4 con NaOH e mantenere il ghiaccio.
nota: Utilizzare 7 ml di tampone di captazione + ligando e aggiungere cocaina. La cocaina viene aggiunta per ottenere una misurazione di fondo dell'assorbimento non specifico di DA da sottrarre dai dati, lasciando solo l'assorbimento specifico di DAT (poiché SERT e NET sono inibiti dalla desipramina, come descritto sopra). In alternativa, è possibile utilizzare un inibitore DAT altamente potente e specifico, GBR-12935.
Importante: d'ora in poi tieni tutto in ghiaccio.
- Preparazione sinaptosomiale
- Sacrifica un topo alla volta mediante lussazione cervicale e decapitazione.
- Taglia la pelle usando le forbici per rivelare il cranio e taglia il tessuto in eccesso posteriore del cranio rimasto dalla decapitazione. Taglia il cranio con piccole forbici dritte lungo la sutura sagittalis, finendo il più anteriormente possibile.
- Posiziona le due punte delle forbici in ciascun occhio del topo e taglia il cranio per rimuovere il resto del cranio e il cervello intatto. Rimuovi rapidamente il cervello e mettilo in PBS ghiacciato. Questo lo manterrà freddo mentre il secondo cervello viene sezionato.
- Utilizzando una matrice cerebrale, sezionare una fetta coronale di 3 mm dello striato (anteriore-posteriore: da +1,5 mm a -1,5 mm), seguita da una dissezione più fine con un perforatore. Vedere la Figura 1 per l'area di perforazione.
- Mantieni il fazzoletto sul ghiaccio in ogni momento muovendoti in avanti.
- Trasferire il fazzoletto in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml per la pesatura.
nota: Questo peso verrà utilizzato nel passaggio 1.2.14.
- Ripeti i passaggi 1.2.1-1.2.6 per il secondo cervello.
- Una volta ottenuto il peso per entrambi i cervelli, trasferire il tessuto in un bicchiere di omogeneizzazione contenente 1 ml di tampone di omogeneizzazione ghiacciato.
- Omogeneizzare il tessuto utilizzando un pestello a motore a 800 giri/min, 10 colpi uniformi.
nota: Un colpo equivale a un'azione su e giù. Il primo colpo dovrebbe essere di circa 5 s, il successivo 3-4 s. L'omogeneizzazione in mezzo isotonico è importante per prevenire lo scoppio dei sinaptosomi. L'uso di una forza appropriata e di un mezzo isotonico consentirà ai terminali presinaptici di risigillare il citoplasma che racchiude, le vescicole sinaptiche, i mitocondri e il citoscheletro.
- Trasferire l'omogenato in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e raccogliere l'omogeneiato rimanente dal vetro di omogeneizzazione sciacquandolo con 0,5 mL di tampone di omogeneizzazione aggiuntivo.
- Tenere il campione sul ghiaccio mentre il tessuto dell'altro cervello viene omogeneizzato. Eseguire i due cervelli in parallelo nei passaggi 1.2.12-1.2.13.
- Pellettare i nuclei e i detriti cellulari mediante centrifugazione (1.000 x g, 10 min, 4°C).
- Trasferire il surnatante (S1) (contenente le membrane cellulari e il citoplasma) in nuove provette per microcentrifuga da 1,5 mL e centrifugare a 16.000 x g per 20 minuti a 4°C.
- Scartare il surnatante (contenente citoplasma) e risospendere il pellet (P2) (contenente sinaptosomi grezzi) in 40 μL di tampone di omogeneizzazione/mg di tessuto (in base al peso ottenuto al punto 1.2.6). Risospendere delicatamente la frazione sinaptosomiale grezza con una pipetta p1000, poiché troppa forza romperà i sinaptosomi.
nota: È importante ottenere almeno 280 μl. In caso contrario, sarà necessario diluire con più di 40 μL per mg. I passaggi 1.2.1-1.2.13 devono essere eseguiti il più velocemente possibile e tutto deve essere tenuto in ghiaccio. Non appena i sinaptosomi grezzi sono stati risospesi in un tampone di omogeneizzazione, sono abbastanza stabili finché sono tenuti in ghiaccio.
2. Esperimento di adozione
- Aggiungere 440 μL di tampone di captazione + ligando + cocaina alle 12 provette per microcentrifuga da 1,5 mL designate e 440 μL di tampone di captazione + ligando alle 36 restanti provette da microcentrifuga da 1,5 mL (vedere la Tabella 1 per il layout).
nota: Rimuoverli dal ghiaccio 15 minuti prima dell'inizio dell'esperimento per portarli a temperatura ambiente, ma tenerli in ghiaccio fino ad allora per conservare gli inibitori.
- Preparare la curva di saturazione (dopamina (2, 5, 6-[3H]-DA) (dopamina 3-H) (91,1 Ci/mmol) a varie concentrazioni finali (0,031, 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5 e 1,0 μM)).
- Etichettare sei provette per microcentrifuga da 2 ml come 10, 5, 2,5, 1,25, 0,62 e 0,31.
- Aggiungere 750 μl di tampone di captazione + ligando alle 5 provette per microcentrifuga con il numero più basso.
- Aggiungere 1.455,4 μL di tampone di captazione + ligando, 14,6 μL di dopamina (1 mM), 30 μl di dopamina 3-H (11 μM) alla provetta etichettata 10.
- Trasferire 750 μl dalla provetta etichettata 10 alla provetta etichettata 5. Mescolare bene e trasferire 750 μl da questa provetta alla provetta da 2,5. Ripetere questa diluizione con le provette rimanenti.
- Presciacquare i filtri in microfibra di vetro con 4 ml di tampone di assorbimento dopo averli posizionati su un secchio filtrante da 12 pozzetti.
- Aggiungere 10 μl della sospensione di membrana sinaptosomica alle prime 24 provette per microcentrifuga da 1,5 mL (vedere la Tabella 1 per il layout) contenenti 440 μl di tampone. Agitare con attenzione e ruotare brevemente per assicurarsi che i sinaptosomi siano immersi nel tampone. Lasciare agire a 37 oC per 10 min.
nota: È importante essere precisi sui tempi durante l'esperimento di assorbimento per un confronto equo tra i cervelli. Usa un cronometro per la precisione.
- Aggiungere 50 μL di dopamina alle concentrazioni di 10 e 5 μM (sezione 2.2) alle prime due colonne e lasciare agire a 37 oC per 5 minuti agitando. Dopo esattamente 5 minuti, interrompere la reazione aggiungendo 1 ml di tampone di assorbimento ghiacciato. Fare lo stesso con le concentrazioni di 2,5 e 1,25 μM (sezione 2.2) e poi con le concentrazioni di 0,62 e 0,31 μM.
- Aggiungere i campioni ai filtri in microfibra pre-risciacquati e lavare con 5 x 4 ml di tampone di assorbimento a freddo ghiacciato. Quando i primi 12 campioni sono stati aggiunti ai filtri, spostare i filtri nei tubi a scintillazione. Ripeti l'operazione con i prossimi 12 campioni.
- Ripeti i passaggi 2.4-2.6 per il cervello successivo.
- Preparare 3 provette per il conteggio massimo posizionando un filtro in microfibra sul fondo delle provette a scintillazione 49-51 e aggiungendo 25 μl della concentrazione massima di dopamina sulla parte superiore (10 μM).
- Lasciare tutti i 51 tubi di scintillazione in una cappa aspirante per 1 ora.
- Aggiungere 3 mL di liquido di scintillazione a ciascuna provetta di scintillazione e agitare energicamente su un agitatore per 1 ora.
- Conta [3H]-DA in un contatore beta per 1 min.
- Apri il programma e scegli: Etichetta: H-3, Piastra/Filtro: Fiala da 4 mL, 4 per 6, Tipo di test: Normale e Tempo di conteggio: 1 min.
nota: Questo passaggio può essere eseguito il giorno successivo, se più conveniente. Lasciare i campioni coperti con carta stagnola per una notte.
- Determinazione delle proteine
- Utilizzare un kit standard per il dosaggio delle proteine BCA per determinare le concentrazioni proteiche dei sinaptosomi per gli aggiustamenti da conteggi per min (cpm) a fmol/min/μg e per un corretto confronto dell'assorbimento tra i campioni.
3. Analisi dei dati
- Utilizzare i dati dell'esperimento di assorbimento per creare una curva di saturazione per ciascun gruppo e calcolare la velocità della reazione (Vmax) e la costante di Michaelis Menten (KM).
nota: Il valore KM riflette la concentrazione del substrato necessaria per raggiungere la metà di Vmax. Di conseguenza, Vmax riflette direttamente la funzione di DAT (massima capacità di assorbimento), che dipende dal numero di DAT sulla superficie e da come la sua attività potrebbe essere modulata da modifiche post-traduzionali e/o proteine interagenti, nonché da alterazioni nei gradienti ionici. Il valore KM è una misura indiretta dell'affinità del substrato per il trasportatore che, soprattutto, può anche essere modulata da modifiche post-traduzionali e/o proteine interagenti. Per valutare completamente i cambiamenti funzionali, è quindi importante determinare direttamente i livelli di espressione superficiale attraverso, ad esempio, un saggio di biotinilazione superficiale.
Tabella 1: Layout della provetta per microcentrifuga per la preparazione sinaptosomiale.
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0,62 | 0,31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0,62 | 0,31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0,62 | 0,31 |
| 10+CoC | 5+CoC | 2.5+CoC | 1.25+CoC | 0,62+CoC | 0,31+CoC |
