Marcatura di interneuroni riempiti di biocitina in fette di ippocampo di ratto per la visualizzazione

Abstract

Fonte: Economides, G., et al. Recupero della biocitina e ricostruzioni 3D di interneuroni CA2 dell'ippocampo riempito. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video mostra la procedura per colorare fette fisse di cervello di ratto contenenti interneuroni pieni di biocitina. Il protocollo include l'incubazione con il complesso avidina-biotina (ABC), la colorazione con HRP e substrato cromogenico, la conservazione delle strutture con tetrossido di osmio e l'inclusione del tessuto nella resina per l'imaging.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato

1. Determinazione della proteina legante il calcio o del contenuto proteico degli interneuroni e visualizzazione della biocitina dopo registrazioni elettrofisiologiche e riempimento di biocitina

Nota: Al termine delle registrazioni elettrofisiologiche, le fette che contengono cellule riempite di biocitina vengono fissate durante la notte prima delle procedure istologiche. La soluzione fissativa verrà sostituita con un singolo cambio di tampone fosfato 0,1 M la mattina successiva se il resto della procedura viene eseguito in un altro giorno al fine di prevenire danni ai tessuti. La soluzione di fissazione (paraformaldeide al 4%, soluzione di acido picrico saturo allo 0,2%, soluzione di glutaraldeide allo 0,025% in tampone fosfato 0,1 M (PB)) deve essere preparata fresca il giorno delle registrazioni per ottenere i migliori risultati.

1. Al termine della registrazione elettrofisiologica, prelevare con cautela con un pennello la fetta contenente la/e cellula/e registrata/e e metterla in un vaso contenente liquido cerebrospinale artificiale (ACSF).
   nota: I dettagli del protocollo utilizzato per la preparazione della fetta e le registrazioni intracellulari utilizzando elettrodi affilati sono stati descritti in precedenza.
2. In una cappa aspirante, raccogli con cura la fetta di cervello con un pennello e arrotolala su un piccolo pezzo di carta da filtro di alta qualità. Mettere un altro pezzo di carta da filtro inumidita sulla fetta e mettere i due pezzi di carta da filtro bagnata in un piccolo vasetto di plastica contenente 5-10 ml di soluzione fissativa e conservare in frigorifero per una notte a 4 °C.
3. Preparare una soluzione di gelatina in acqua distillata. Mettere 20 ml di acqua distillata in un becher su una piastra calda e scaldarla a 60 °C. Aggiungere progressivamente 2,4 g di gelatina all'acqua, attendere che si sciolga e lasciarla raffreddare a 35-40 °C prima dell'uso per evitare danni ai tessuti.
4. Sostituire la soluzione fissativa con 2 mL di 0,1 M PB. Mettere la fetta in una capsula di Petri e tagliare via il tessuto in eccesso con una lama di bisturi. Posizionare il fazzoletto rifilato in una capsula di Petri (diametro di 9 cm, altezza di 1,4 cm), assicurandosi che sia piatto senza pieghe o pieghe, e rimuovere il tampone in eccesso utilizzando un pennello asciutto.
5. Coprire il fazzoletto con la soluzione di gelatina calda e posizionare la capsula di Petri su un blocco congelato per raffreddare rapidamente la soluzione.
6. Usando una lampada ad angolo per creare contrasto, guarda attraverso il lato del piatto e mantieni la fetta piatta esercitando una leggera pressione con un pennello fine fino a quando la gelatina inizia a solidificarsi.
   nota: La gelatina può essere ri-sciolta se il tessuto non è piatto. Eventuali imperfezioni sulla superficie della gelatina causate dalla rimozione del pennello durante la solidificazione possono essere rimosse fondendo delicatamente lo strato superficiale spostando il bulbo della lampada vicino alla superficie per alcuni secondi.
7. Spostare la teglia di gelatina in frigorifero e lasciare a 4 °C per 30-60 minuti.
8. In una cappa aspirante, ritagliare un piccolo blocco (~ 1 x 1 cm) contenente il tessuto incorporato nella gelatina del piatto utilizzando una lama di bisturi, sollevare il blocco con una piccola spatola e posizionarlo con cura nella stessa soluzione fissativa fresca utilizzata per fissare le fette per almeno 30 minuti a 4 °C.
9. Lavare il blocco di gelatina in 5 ml di 0,1 M PB tre volte, asciugarlo con un pezzo di carta velina e incollare il blocco con il lato rivolto verso l'alto (cioè con il fazzoletto in alto) su un mandrino vibrante usando la super colla.
10. Rimuovere la colla in eccesso con un pezzo di carta da filtro e utilizzare una lama di bisturi per tagliare gli angoli del blocco, lasciando una forma a diamante.
11. Sezionare la fetta a 50 μm di spessore utilizzando un vibratomo e posizionare accuratamente ogni sezione in una fiala di vetro contenente il 10% di saccarosio.
12. Prelevare con cautela una sezione dalla fiala e posizionarla in piano nel coperchio di una capsula di Petri. Utilizzando un microscopio da dissezione e una lama di bisturi nuova, rimuovere la gelatina intorno alla sezione e rimettere la sezione in una fiala contenente 2 ml di saccarosio fresco al 10%
    nota: In questa fase è fondamentale rimuovere quanta più gelatina possibile per ridurre il restringimento dei tessuti durante la fase di disidratazione (Passaggio 1.37).
13. Crioproteggere le sezioni in una soluzione di saccarosio-glicerolo a base di 0,1 M PB a temperatura ambiente incubandole per 10 minuti in una soluzione di saccarosio al 10%, 20 minuti in una soluzione di saccarosio al 20%, 6% glicerolo due volte e infine 30 minuti in una soluzione di saccarosio al 30%, 12% glicerolo due volte sotto agitazione costante.
14. Posiziona le sezioni in piano su un piccolo rettangolo di carta stagnola usando un pennello. Rimuovere il liquido in eccesso dalle sezioni e piegare con cura la carta stagnola in un pacco.
15. Tenere la particella vicino alla superficie dell'azoto liquido senza toccare la superficie per 30 s e poi lasciare scongelare completamente le sezioni per circa 30 s. Ripetere il congelamento-scongelamento altre due volte.
16. Rimuovere tutte le sezioni con un pennello e metterle in una fiala di vetro contenente 2 ml di 0,1 M di PB sotto costante agitazione per lavare via il saccarosio in eccesso.
17. Rimuovere il PB con una pipetta Pasteur e incubare le sezioni in 2 mL di perossido di idrogeno acquoso all'1% (H₂O₂) per 30 min. Lavare le sezioni in 2 mL di PB 0,1 M 3x 5 min.
18. Rimuovere il PB 0,1 M con una pipetta Pasteur e aggiungere l'1% di boroidruro di sodio (NaBH₄) in 0,1 M PB.
    nota: Non tappare il flaconcino, poiché la soluzione di NaBH₄ rilascia idrogeno gassoso.
19. Rimuovere il boroidruro di sodio con una pipetta Pasteur e lavare accuratamente le sezioni in 2 mL di 0,1 M PB 5x 5 min.
20. Sostituire 0,1 M PB con il 10% di siero normale di capra (NGS) in 0,1 M PB per 30 minuti.
21. Rimuovere il siero di capra e incubare le sezioni per una notte a 4 °C in una miscela di anticorpi monoclonali di topo e policlonali di coniglio costituiti in soluzione ABC.
    nota: Nella Tabella 1 è riportato un elenco degli anticorpi primari utilizzati in studi precedenti.
22. Incubare le sezioni per 2 ore al buio in una miscela di anticorpi secondari marcati in fluorescenza (Tabella dei materiali).
23. Montare le sezioni sui vetrini in mezzo di montaggio e coprirle con un vetrino coprioggetti.
24. Scattare immagini della marcatura a fluorescenza con ingrandimento 40X (Figura 1Bb).
25. Dopo l'imaging a fluorescenza, posizionare il vetrino in una capsula di Petri di vetro contenente PBS e rimuovere con cura il vetrino coprioggetti. Quindi lavare le sezioni dal vetrino utilizzando delicati impulsi di PBS da una pipetta Pasteur. Mettere le sezioni in un flaconcino di vetro pulito contenente PBS.
26. Eseguire la reazione avidina-HRP incubando prima le sezioni in ABC per almeno 2 ore per amplificare il prodotto della reazione HRP.
27. Preparare la soluzione di 3,5 diaminobenzidina (DAB) aggiungendo una compressa a 5 ml di acqua distillata.
28. Lavare le sezioni con PBS tre volte per 10 minuti e poi con il tampone Tris due volte per 10 minuti. Rimuovere il tampone Tris dopo l'ultimo lavaggio.
29. Aggiungere rapidamente una goccia di soluzione di NiCl₂ (cloruro di nichel) all'8 % alla soluzione DAB, pipettare la soluzione dentro e fuori per miscelarla e aggiungere rapidamente 1 mL di questa soluzione sulle sezioni. Incubare le sezioni nella soluzione DAB/NiCl₂ per 15 minuti.
30. Aggiungere 10 μl di 1% H₂O₂ alla soluzione DAB. Lasciare che la reazione proceda al buio sotto costante agitazione per circa 1 o 2 minuti e monitorare l'etichettatura delle cellule riempite con un microscopio da dissezione.
31. Arrestare la reazione rimuovendo la soluzione DAB/NiCl₂/H₂O₂ e lavare due volte le sezioni con tampone Tris per 5 minuti.
32. In una cappa aspirante, posizionare un piccolo cerchio di carta da filtro in una capsula di Petri e inumidirlo con 0,1 M PB. Sollevare le sezioni una alla volta dalla fiala di vetro utilizzando un pennello e posizionarle con cura sulla carta.
33. Coprire le sezioni con un altro cerchio inumidito di carta da filtro e rimuovere il tampone in eccesso toccando delicatamente la superficie con carta velina.
34. Applicare 8-9 gocce di tetrossido di osmio all'1% in 0,1 M PB sulla carta superiore, coprire il piatto e conservare nella cappa aspirante per almeno 30 minuti, ma non più di 1 ora.
35. Aprire la capsula di Petri e sollevare la carta da filtro superiore. Sollevare con cautela le sezioni una alla volta con un pennello, metterle in una fiala di vetro e sciacquarle due volte in acqua distillata.
36. Smaltire in modo appropriato i rifiuti di tetrossido di osmio. Sciacquare tutte le attrezzature usa e getta e riporle negli appositi contenitori.
37. Posizionare ogni sezione in piano su un vetrino e far scivolare le sezioni. Trasferire il vetrino in una capsula di Petri, posizionare una fiala di vetro vuota sopra il vetrino coprioggetti per tenerlo in posizione e coprire con alcol al 50%. Dopo 15 minuti, rimuovere il vetrino dalla soluzione e rimuovere le sezioni dal vetrino. Riposizionare le sezioni sul vetrino e poi immergere il vetrino in alcol al 70% per 15 minuti. Ripetere lo stesso processo con una soluzione alcolica al 95% e infine al 100%.
38. Dopo la fase di disidratazione, trasferire le sezioni in una fiala di vetro contenente alcol al 100% su uno shaker in una cappa aspirante. Sostituire la soluzione alcolica con ossido di propilene (C₃H₆O) e lavare tre volte per 5 minuti. Dopo l'ultimo lavaggio, conservare ~2 mL di ossido di propilene nella fiala e aggiungere resina (rapporto 1:1). Assicurarsi che la resina sia disciolta e mantenere le sezioni sotto costante agitazione per 30 minuti.
39. Posizionare ogni sezione in una planchette di alluminio contenente resina epossidica utilizzando un bastoncino di legno e incubare durante la notte.
    NOTA: Non lasciare le sezioni nella resina per più di 24 ore per evitare il rischio di danneggiare le sezioni.
40. Posizionare la planchette su una piastra calda per circa 10 minuti. Raccogliere ogni sezione con un bastoncino di legno e posizionarla su un vetrino pulito. Mantieni coerente l'orientamento di ogni sezione utilizzando un microscopio da dissezione. Posiziona un vetrino coprioggetti sulle sezioni. Mettere il vetrino in forno per 48 ore a 56 °C per l'indurimento.

Tabella 1: Tabella delle soluzioni.

Soluzioni utilizzate	Composizione/Istruzioni
Soluzione di fissaggio	Paraformaldeide al 4%, soluzione di acido picrico saturo allo 0,2%, soluzione di glutaraldeide allo 0,025% in tampone fosfato (PB) 0,1 M
tampone fosfato 0,1M pH 7,6	Aggiungere 100 mL di tampone fosfato 1 M a 900 mL di acqua distillata
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) pH 7,4/7,5	Aggiungere 10 mL di tampone fosfato 0,1M, 0,2 g di KCl e 8,76 g di NaCl a 990 mL di acqua distillata
tampone TRIS pH 7,5	Sciogliere 5,72 g di Tris cloridrato e 1,66 g di Tris Base in 50 ml di acqua distillata. Quindi preparare fino a 1 L con acqua distillata.
Soluzione fissativa tamponata di glutaraldeide e paraformaldeide	Paraformaldeide al 4%, soluzione di acido picrico saturo allo 0,2%, soluzione di glutaraldeide allo 0,025% in tampone fosfato 0,1 M.
Soluzione ABC	Soluzione da preparare almeno 30 minuti prima dell'uso dal kit ABC. Aggiungere 1 goccia di soluzione A e 1 goccia di soluzione B a 2,5 mL di PBS.
Resina epossidica Durcupan:	Per fare 20 vasi: 20 g di componente A, 20 g di componente B, 0,6 g di componente C e 0,4 g di componente D-
	Proteggere la bilancia dalle fuoriuscite coprendo la piastra con un cerchio di carta da filtro. Pesare attentamente i reagenti in un becher tripour nelle proporzioni sopra indicate. Mescolate accuratamente mescolando energicamente con due bastoncini di legno per almeno 5 min. Il composto dovrebbe assumere una densità uniforme di colore marrone scuro. Mettere il bicchiere in forno a ~50 °C per un massimo di 10 minuti per rimuovere il maggior numero possibile di bolle d'aria. nota: La resina inizierà a polimerizzare se si lascia il bicchiere nel forno per più di 10 minuti. Decantare la resina in barattoli di plastica o siringhe da 5 mL, datarle e conservarle nel congelatore a -20 °C pronte per l'uso.

Risultati

Figura 1: Ricostruzioni neuronali di due tipi di cellule cesto registrate e riempite nella regione CA2 dell'ippocampo e dati elettrofisiologici correlati ottenuti a seguito di registrazioni intracellulari in vitro. Questa cifra è stata modificata rispetto a studi precedenti. SO Stratum Oriens, SP Stratum Pyramidale, SR Stratum Radiatum, SLM Stratum Lacunosum Moleculare. (

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anticorpo dell'acido avidina-7-ammino-4-metilcumarina-3-acetico (avidina-AMCA) - 20,8 mg/mL	Laboratori vettoriali	A2008
Biocitina ≥98% (TLC)	Sigma	B4261
3,5 compresse di diaminobenzidina (DAB), per preparare 5 ml	Sigma	D4293
Resina epossidica Durcupan A	Sigma	44611
Resina epossidica Durcupan B	Sigma	44612
Resina epossidica Durcupan C	Sigma	44613
Resina epossidica Durcupan D	Sigma	44614
Etanolo, puriss. P.A., Assoluto, ≥99,8%	Sigma	32221
Gelatina	Sigma	48723
Soluzione di glutaraldeide, grado I, 25 % in H2O	Sigma	G5882
Glicerolo, ≥99%	Sigma	G5516
Siero di capra	Sigma	G9023
Isotiocianato di fluoresceina anti-topo di capra (FITC)- 14,3 mg/mL	Sigma	F2653
Capra anti-coniglio Texas Red (TR)- 3,3 mg/mL	Invitrogen	T2767
Perossido di idrogeno, soluzione al 30%	Sigma	H-1009
Olio da immersione, viscosità 1.250 cSt (lit.)	Sigma	I0890
Cloruro di nichel	Sigma	N5756
Tetrossido di osmio, per microscopia elettronica, 4% in acqua	Sigma	75632
Paraformaldeide, grado di reagente, cristallina	Sigma	P6148
Acido picrico, inumidito con acqua, ≥98%	Sigma	197378
Tampone fosfato 1 M	Sigma	P3619
Ossido di propilene, 99%	Alfa Aesar	30765
Tetraidroborato di sodio	VWR	27885.134
Saccarosio	Fisher scientifico	S/8600/53
Trizma cloridrato, ≥99,0%	Sigma	T5941
Base di Trizma, ≥99,9%	Sigma	T6066
Vectashield Antifade Mounting Medium, , indice di rifrazione 1,45	Laboratori vettoriali	H-1000
Kit HRP Vectastain Elite ABC	Laboratori vettoriali	PK6100
Attrezzatura usata
Vibratome	Agar Scientifico
C4A Planchette in alluminio a coppa	GA-MA & ASSOCIATES, INC.
Microscopio Leica DMR	Leica Microsystems
Sorgente luminosa a fluorescenza X-Cite 120PC Q	Excelitas Technologies
Fotocamera digitale per microscopio Leica DFC450	Leica Microsystems
Penna da disegno tecnica Rapidograph 0,18 mm	Centro grafico di Londra
0,18 mm	Centro grafico di Londra
Penna da disegno tecnica Rapidograph 0,25 mm	Centro grafico di Londra
0.25mm	Centro grafico di Londra
Sistema Neurolucida che include postazione PC, palco, telecamera e joystic per il controllo del palco XYZ	Microbrighfield (MBF) Bioscienze
Neurolucida software versione 2017	Microbrighfield (MBF) Bioscienze
CorelDRAW graphics Suite X5	Corel
Software di editing video	Adobe Premiere Pro
Fiale di vetro 14 mL	Fisher scientifico

Pennino rapidograph da Pennino rapidograph