Valutazione della compromissione motoria nei modelli di C. elegans utilizzando il saggio di locomozione radiale

Abstract

Fonte: Currey, H. N., et al. Valutazione della compromissione motoria nei modelli di C. elegans di sclerosi laterale amiotrofica. J. Vis. Exp. (2021).

Questo video dimostra l'uso di un test di locomozione radiale per valutare la disfunzione motoria in C. elegans che esprime la proteina TDP-43 umana wild-type o ALS-mutant. I vermi con livelli variabili di espressione di TDP-43 wild-type o mutante sono autorizzati a strisciare e il loro movimento è misurato dalla distanza radiale percorsa dal punto centrale sulla piastra del saggio. Il test distingue tra menomazioni motorie lievi, moderate e gravi in base alla distanza percorsa dai diversi ceppi di C. elegans.

Protocollo

1. Saggio di locomozione radiale

1. Preparare piastre di Petri da 100 mm o 150 mm di diametro piene per metà di terreno di crescita dei nematodi (NGM) e seminate con un prato uniforme di batteri OP50 per coprire l'intera superficie dell'agar.
2. Capovolgere le piastre del saggio NGM ed etichettare il fondo con un identificatore per i ceppi di C. elegans da analizzare, 2 piastre per ceppo (Figura 1A).
3. Fai un piccolo punto con il pennarello al centro della piastra capovolta (Figura 1A).
4. Mentre si lavora con un microscopio da dissezione, trasferire 15-20 vermi abbinati allo stadio al centro della piastra di analisi direttamente sopra il punto centrale (visibile attraverso l'NGM) utilizzando un plettro a filo di platino (Figura 1B).
   nota: Cerca di trasferire tutti i vermi contemporaneamente o il più rapidamente possibile.
   1. Imposta un timer per 30 minuti dopo che i vermi sono stati posizionati al centro del piatto. Rimettere il coperchio sul piatto e metterlo da parte (Figura 1C).
5. Continuare a trasferire i vermi fino a quando tutti i ceppi non si trovano sulle piastre di analisi designate, prendendo nota approssimativamente del tempo necessario per il trasferimento tra le piastre (mirare a ~ 1 min tra le piastre). Mantenere tutte le piastre nello stesso ordine in cui sono state installate.
6. Dopo 30 minuti, inizia a segnare il primo piatto.
   1. Rimuovere il coperchio e posizionare la piastra a faccia in giù sotto il microscopio da dissezione, in modo che il retro etichettato della piastra sia rivolto verso l'alto e l'agar NGM si trovi tra la linea di vista e i vermi. La piastra sarà capovolta rispetto al normale utilizzo.
   2. Regolare la messa a fuoco del microscopio fino a quando i vermi sono visibili attraverso l'agar.
   3. Usando un pennarello di colore diverso dal punto centrale, metti un piccolo punto nella posizione di ogni verme: segui le tracce dei vermi attraverso il prato batterico per trovare gli animali più distali.
   4. Controlla il bordo della piastra poiché alcuni vermi potrebbero finire lì. Inoltre, conta e registra il numero di vermi nel punto centrale (Figura 1D).
7. Continuare a marcare tutte le piastre di analisi in ordine, in modo che tutte le piastre abbiano un tempo di attività di 30 minuti, facendo attenzione a tenere conto del tempo necessario per impostare la piastra. Quindi, eseguire misurazioni manuali o digitali come descritto nei passaggi 1.8 o 1.9.
8. Eseguire misurazioni manuali utilizzando un righello.
   1. Usa un righello per misurare in mm la distanza dal punto centrale ai segni di posizione finale per ogni verme e registra la distanza. Per tenere traccia dei progressi durante il punteggio, etichettare il primo punto segnato con una piccola linea di marcatura.
   2. Registrare i dati di lunghezza per ogni punto consecutivamente ruotando la piastra in senso orario (Figura 1E).
9. Esegui la misurazione digitale utilizzando uno scanner e ImageJ.
   1. Utilizzando uno scanner piano, eseguire la scansione del retro delle piastre di analisi accanto a un righello (numeri rivolti verso la superficie di scansione) (Figura 2A).
   2. Aprire l'immagine della lastra acquisita in ImageJ o in un programma simile.
      nota: ImageJ è un software gratuito di elaborazione delle immagini basato su Java ospitato dal NIH.
   3. Fare clic sullo strumento Linea retta e quindi tracciare una linea che colleghi i punti di 1 cm e 2 cm sull'immagine scansionata del righello (Figura 2B).
      nota: Tenendo premuto il tasto Maiusc del computer, la linea verrà forzata all'angolo di 45° più vicino.
   4. Passare al menu Analizza e utilizzarlo per impostare la scala (Analizza | Imposta scala) (Figura 2C).
   5. Immettere la distanza nota (10) e le unità di lunghezza (mm) nelle caselle appropriate, non regolare la distanza in numero di pixel. Selezionare Globale per applicare la stessa scala a tutte le immagini analizzate in ogni sessione ImageJ; in caso contrario, impostare la scala per ciascuna immagine all'apertura (Figura 2D). Fare clic su Ok.
      nota: I passaggi 1.9.2-1.9.5 vengono eseguiti per impostare la scala di misurazione. Le misurazioni per questa immagine ora metteranno automaticamente in relazione la lunghezza delle linee con la relazione pixel: lunghezza definita. Le immagini acquisite a 300 dpi avranno un rapporto approssimativo di 11,8 pixel per mm.
   6. Usa lo strumento Pennello per segnare appena sopra il primo punto da segnare.
      nota: Questo è un indicatore visivo per il primo verme segnato.
   7. Utilizzare lo strumento Linea retta per disegnare una linea dal punto centrale al primo punto dati del verme.
   8. Fare clic sul tasto M sulla tastiera per misurare la distanza. In alternativa, accedere al menu Analizza e scegliere Misura (Analizza | Misura). In entrambi i casi, la misurazione apparirà in una nuova finestra; Questa finestra raccoglierà tutte le misurazioni per immagine.
   9. Mantenendo costante il punto centrale, spostare l'estremità della linea che tocca il primo punto della vite senza fine al punto della vite senza fine successivo, spostandosi in senso orario, e fare clic sul tasto M per misurare.
   10. Continua a misurare ogni punto in senso orario fino a quando tutti i punti non vengono segnati.
   11. Copia e incolla i dati di misurazione della lunghezza in un foglio di calcolo per salvarli. Quindi, ripetere il processo per ogni immagine di lastra scansionata.
       nota: I passaggi 1.9.6 - 1.9.11 misurano i valori di spostamento della vite senza fine (Figura 2E-F).
10. Eseguire analisi statistiche.
    1. Combina le repliche all'interno di un singolo esperimento in modo che il numero totale di vermi sia compreso tra 30 e 40.
    2. Esegui repliche sperimentali indipendenti in giorni diversi e con popolazioni indipendenti di vermi per finire con 3 repliche sperimentali indipendenti.
    3. Analizza i dati utilizzando analisi statistiche appropriate come il t-test di Student per 2 ceppi o l'ANOVA a 1 via per tre o più ceppi.

Risultati

Figura 1: Flusso di lavoro del saggio di locomozione radiale. I pannelli A-E mostrano i passaggi generalizzati del saggio di locomozione radiale. I passaggi sono i seguenti: (A) Le piastre NGM, con OP50 seminato ai bordi, vengono preparate etichettando e contrassegnando il punto centrale, (B) i vermi vengono posizionati al centro dell'agar come cont...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
C. elegans	Centro di Genetica Caenorhabditis (CGC)	-	Acquistate le vostre varietà come desiderate, N2 è un'utile varietà di controllo
Pipette pasteur monouso, vetro borosilicato	VWR	14673-010	Pipetta di vetro utilizzata per creare il plettro a vite senza fine: tenere la pipetta di vetro in una mano e ~ 1 "di filo di platino (tenuto da pinze) nell'altra su una fiamma per unire.
Piastre di Petri monouso, 35x10mm	VWR	10799-192	Piastre di analisi per il sistema di imaging WormLab
Piastre di Petri monouso, 60x15mm	VWR	25384-090	Piastre di scorta per vermi
Piastre di Petri monouso, 100x15mm	VWR	25384-302	Piastra standard per il saggio di locomozione radiale
Piastre di Petri monouso, 150x15mm	VWR	25384-326	Piastra per il saggio di locomozione radiale con un intervallo di tempo più lungo
Microscopio da dissezione	Leica	M80	Ambito di applicazione per la manutenzione dei vermi e l'impostazione dei saggi di locomozione radiale
Marcatori a punta fine	VWR	52877-810	Sono necessari almeno 2 colori per i saggi di locomozione radiale. Per la precisione sono necessarie punte di precisione.
Scanner piano	Amazzonia	Epson Perfection V850	Opzionale per il saggio di locomozione radiale. Il protocollo presuppone una risoluzione di 300 dpi, la maggior parte degli scanner funzionerebbe bene
NGM (terreno di crescita dei nematodi)	VWR	76347-412	Mezzo utilizzato per coltivare C. elegans. Può essere fatto da zero, vedi WormBook: Manutenzione di C. elegans
Batteri OP50	Centro di Genetica Caenorhabditis (CGC)	OP50	Fonte di cibo primaria per C. elegans
P1000 pipettatore	VWR	76207-552	Pipettor, utilizzato nel saggio di nuoto
P1000 suggerimenti	VWR	83007-384	Punte per pipettatore, utilizzato nel saggio di nuoto
Filo di platino, diametro 0,2032 mm	VWR	BT136585-5M	Filo di platino di calibro fine utilizzato per creare un plettro a vite senza fine: tenere la pipetta di vetro in una mano e ~ 1" di filo di platino (tenuto da pinze) nell'altra su una fiamma per unire.
Sovrano	VWR	56510-001	Necessità di valutare i saggi di locomozione radiale
ImageJ	NIH	-	Software gratuito opzionale fornito da il NIH - https://imagej.nih.gov/ij/
Sistema di imaging WormLab	MBF Bioscienze	WormLab	Il sistema di imaging include Hardware WormLab (campo chiaro palcoscenico, telecamera e alloggiamento) e il software WormLab. https:// www.mbfbioscience.com/wormlabimaging- sistema