Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Preparazione
- Preparazione e sezionamento dei tessuti
- Assegnare i ratti in modo casuale in tre gruppi: fresco/salino (SAL; 0,9% NaCl), prefissato/SAL e prefissato/3,4-metilendiossimetamfetamina (MDMA; vedere i dettagli nella tabella 1).
- Somministrare tre dosi di 1 ml/kg di SAL e 10 mg/kg di MDMA per via intraperitoneale, rispettivamente, ai gruppi SAL e MDMA a intervalli di 2 ore. Lasciare che gli animali sopravvivano al trattamento per 6 giorni.
- Il giorno 7, somministrare 100 mg/kg di ketamina in combinazione di 5 mg/kg di xilazina per via intraperitoneale ai ratti per un'anestesia profonda (cioè, perdita dei riflessi di battito delle palpebre corneali e pizzicamento della coda).
- Per il gruppo fresco/SAL, decapitare rapidamente i ratti e rimuovere il cervello per il test del cervello fresco.
- Per i gruppi prefissato/SAL e prefissato/MDMA, praticare un taglio lungo lo sterno di circa 10-12 cm e poi esporre l'estremità dello sterno.
- Tenere l'estremità dello sterno con un emostatico e tagliare il diaframma lateralmente su entrambi i lati con forbici affilate, quindi tagliare verso l'alto attraverso le costole e parallelamente ai polmoni.
- Con una mano, tieni la punta ventrale del cuore con una piccola pinza. Con l'altra mano, perforare il ventricolo sinistro con un ago da siringa da 18 G (notare che il lato adattatore dell'ago è collegato con un tubo in silicone a forma di Y a contenitori di SAL e paraformaldeide ghiacciati e pompe peristaltiche).
- Accendere la pompa SAL al livello medio della portata (~5 ml/min) e forare l'atrio destro con la pinza per consentire la fuoriuscita del circolo di ritorno. Mantenere la perfusione SAL per 30 minuti.
- Accendere la pompa per paraformaldeide a livello medio e lasciare che la paraformaldeide ghiacciata al 4% perfondi l'animale per 30 minuti.
- Rimuovere lo strumento di perfusione e decapitare l'animale. Fai un taglio posteroanteriore attraverso la linea mediana del cranio, quindi fai scorrere il cranio per esporre la cavità del cranio.
- Rimuovere il cervello con una spatola dalla cavità cranica e posizionare il cervello in una provetta da centrifuga da 50 ml contenente 25 ml di paraformaldeide al 4%. Tenere il cervello all'interno del tubo contenente paraformaldeide a 4 ºC in frigorifero per 24 ore.
- Spostare il cervello in una provetta da centrifuga da 50 ml contenente 25 ml di soluzione di saccarosio al 30% a 4 ºC per 3 giorni. Infine, conservare il cervello all'interno di sacchetti di plastica a -80 °C fino al momento dell'uso.
- Montare il cervello su un mandrino con mezzi di inclusione e congelare il mezzo di inclusione contenente cervello in un criostato a una temperatura di -26 ºC. Tagliare il cervello fresco congelato in sezioni da 20 μm e il cervello con prefisso paraformaldeide in sezioni da 10 μm. Trasferire la sezione su un vetrino da microscopio a temperatura ambiente (RT) toccando il vetrino con la sezione.
- Asciugare all'aria a RT per 4 ore. Conservare i vetrini della sezione in un sacchetto ermeticamente sigillato a -80 °C fino al momento dell'uso.
- disidratazione
- Prelevare i vetrini dal congelatore a -80 °C e assegnare le sezioni in uno dei tre test: gene del recettore della serotonina 5-HT2A (ht2a), ppiB (gene della peptidilprolil isomerasi B, controllo positivo) o dapB (gene batterico della diidrodipicolinato reduttasi, controllo negativo); contrassegnare ed etichettare le sezioni con una penna a sfera (non usare una matita). Immergere i vetrini in alcol al 100% a RT per 5 minuti. Asciugare le diapositive per 5 minuti in una cappa aspirante.
- pretrattamento
- Pipettare 20 μl del reagente di pretrattamento-1 (inattivazione della fosfatasi alcalina) nelle sezioni sui vetrini. Posizionare i vetrini su una guida per rack in un vassoio per l'umidità (si noti che il vassoio è coperto con un coperchio per mantenere un'umidità elevata e prevenire l'evaporazione dalla soluzione di reazione).
- Agitare delicatamente il vassoio di umidità su un agitatore orizzontale a bassa velocità per 10 minuti. Lavare i vetrini due volte con acqua bidistillata (ddH2O) per 2 minuti. Immergere il vetrino in un becher da 200 ml contenente 150 ml del reagente Pretrattamento-2 (rottura dei legami incrociati indotta dalla fissazione con paraformaldeide). Far bollire i vetrini per un totale di 5 minuti a 100 ºC (ripristino della struttura dell'RNA indotto dal calore).
- Lavare i vetrini due volte con ddH2O per 2 minuti. Immergere i vetrini in alcool al 100% per 5 minuti. Asciugare i vetrini per 5 minuti nella cappa aspirante. Utilizzare una penna idrofobica per disegnare un cerchio attorno all'area selezionata nella sezione del tessuto (ad esempio, strutture non corticali, inclusi talamo e ipotalamo come descritto nella Figura 1).
- Pipettare 10 μl del reagente Pretreatment-3 (aumenta la penetrazione della sonda) in ciascuna area selezionata e coprire il vassoio di umidità con il coperchio. Posizionare la teglia nel forno di ibridazione dotato di scuotitore orizzontale e impostare la temperatura del forno a 40 ºC; Agitare delicatamente la teglia per 30 minuti. Lavare i vetrini due volte con ddH2O per 2 min.
2. Ibridazione e amplificazione
- Pipettare 10 μl di reagenti per sonde htr2a, ppiB e dapB, rispettivamente, sulle aree selezionate. Coprire la vaschetta dell'umidità con il coperchio per evitare l'evaporazione del reagente. Agitare delicatamente lo shaker orizzontale impostato a bassa velocità. Incubare i vetrini a 40 ºC in forno per 2 ore.
- Lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per 2 minuti. Pipettare 10 μl del reagente Amplification-1 su ciascuna area selezionata, agitare e incubare i vetrini a 40 ºC per 30 minuti.
- Lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per 2 minuti. Pipettare 10 μl del reagente Amplification-2 su ciascuna area selezionata, agitare e incubare i vetrini a 40 ºC per 15 minuti.
- Lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per 2 minuti. Pipettare 10 μl del reagente Amplification-3 su ciascuna area selezionata, agitare e incubare i vetrini a 40 ºC per 30 minuti.
- Lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per 2 minuti. Pipettare 10 μl del reagente Amplification-4 su ciascuna area selezionata, agitare e incubare i vetrini a 40 ºC per 15 minuti.
- Lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per 2 minuti. Pipettare 10 μl del reagente Amplification-5 su ciascuna area selezionata, agitare e incubare i vetrini a RT per 30 minuti.
- Lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per 2 minuti. Pipettare 10 μl del reagente Amplification-6 su ciascuna area selezionata, agitare e incubare i vetrini a RT per 15 minuti. Lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per 2 minuti.
3. Rilevamento del segnale
- Pipettare 10 μl di reagente Red in ciascuna area selezionata (si noti che il reagente è una miscela di Red-B e Red-A in un rapporto di 1:60 e deve essere utilizzato immediatamente). Posizionare il vetrino nella vaschetta dell'umidità sull'agitatore orizzontale a RT e agitare delicatamente a bassa velocità per 10 minuti.
- Lavare i vetrini due volte con (ddH2O) per 10 minuti. Asciugare i vetrini a 60 ºC in forno per 15 minuti. Posizionare i vetrini in xilene sotto la cappa aspirante per 5 minuti. Pipettare 20 μl di terreno di montaggio a base di xilene su ciascuna area selezionata e coprire con un vetrino coprioggetti.