Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Affettare il cervello
- Orientare il campione in modo che il lato dorsale del cervelletto si trovi sul lato anteriore. Versare a freddo l'ACSF (Liquido cerebrospinale artificiale), contenente 1 μM di TTX (Tetrodotossina), sufficiente per immergere completamente il cervelletto. Posizionare un tubo del gas nell'ACSF e iniziare a gorgogliare con la miscela di gas O2/CO2.
- Rimuovere la materia aracnoidea usando una pinzetta fine sotto il binocolo. Tagliare il peduncolo cerebellare con una lama e rimuovere il tronco encefalico e il blocco di agar. Ruotare il vassoio di 180°, in modo che la superficie dorsale del cervelletto sia rivolta verso una lama di rasoio.
- Impostare la lama e regolare la prima posizione di taglio. Impostate i parametri di slicing del vibratomo su quanto segue: ampiezza a 5,5, frequenza a 85 Hz, velocità a 3-4 e spessore della fetta a 300 μm.
- Trasferire la fetta cerebellare su una rete di nylon in un'incubatrice acrilica e immergere completamente la fetta nell'ACSF ossigenato. L'incubatrice deve essere posta in un bagno d'acqua che mantenga una temperatura di 26 °C.
- Conservare le fette per almeno 1 ora per consentire il recupero dai danni durante l'affettatura.
2. Registrazione Patch-clamp a cella intera
NOTA: Una registrazione patch-clamp richiede le seguenti apparecchiature: un microscopio verticale con ottica a contrasto interferenziale differenziale infrarosso (IR-DIC), un amplificatore patch-clamp, digitalizzatore di dati, stimolatore digitale, isolatore, computer, software per l'acquisizione e l'analisi dei dati, manipolatore motorizzato, piattaforma per microscopio, tavolo di isolamento dalle vibrazioni, gabbia di Faraday, sistema di riscaldamento della soluzione, pompe peristaltiche ed estrattore di elettrodi.
- Aggiungere picrotossina (0,1 mM) all'ACSF e risolverlo utilizzando l'ultrasonicazione per 3 minuti.
- Perfondere una camera di registrazione con ACSF saturo di O2-CO2 contenente picrotossine alla velocità di 2 mL/min. Mantenere la temperatura della camera di registrazione a circa 30 °C.
- Realizzare un elettrodo di registrazione tirando un capillare in vetro borosilicato con filamento (diametro esterno = 1,5 mm) utilizzando un estrattore a 4 passi. Il diametro della punta dovrebbe essere di circa 1 μm.
- Realizzare un elettrodo stimolante tirando lo stesso capillare usando l'estrattore con 2 passi, quindi rompere per produrre una punta sottile colpendo la punta contro un blocco di ferro al microscopio binoculare. Il diametro finale dovrebbe essere di 3-5 μm.
- Trasferire la fetta cerebellare nella camera di registrazione e fissarla con un peso Pt con fili di nylon. Riempire un elettrodo stimolante con ACSF.
- Per la stimolazione dei PF, posizionare l'elettrodo stimolante sulla superficie dello strato molecolare, a circa 50 μm di distanza dallo strato cellulare di Purkinje.
- Per la stimolazione della FC, posizionare l'elettrodo stimolante nella parte inferiore dello strato di cellule di Purkinje (passaggi 3.3, 3.4).
- Soluzione interna filtrante a base di K+ o Cs+ con filtro da 0,45 μm. Utilizzare un microcaricatore per riempire un elettrodo di registrazione con 8 μL di soluzione interna.
- Applicare una debole pressione positiva sull'elettrodo di registrazione prima di immergerlo nell'ACSF. La sua resistenza dovrebbe essere di 2-4 MΩ e il potenziale giunzionale del liquido dovrebbe essere corretto.
- Avvicinati al corpo cellulare sano e luminoso del PC con l'elettrodo di registrazione. Spingere leggermente la superficie della cella di Purkinje, smettere di applicare una pressione positiva, quindi applicare una pressione negativa fino a formare una tenuta giga-ohm. Quindi stabilire la configurazione dell'intera cella utilizzando la pressione negativa.
- Mantenere il potenziale di membrana a -70 mV e applicare un impulso di -2 mV (durata, 100 ms) a 0,1 Hz per monitorare continuamente la resistenza di ingresso, la resistenza in serie e la capacità di ingresso. Non utilizzare la compensazione della resistenza in serie. Scartare i dati quando la resistenza in serie varia di oltre il 15%.
3. Induzione di LTD (Depressione a lungo termine)
- Stimolare lo strato molecolare con un impulso (durata, 0,1 ms). Identificare le correnti postsinaptiche eccitatorie PF (fibre parallele) (EPSC) applicando uno stimolo a doppio impulso (intervallo interspike (ISI) di 50 ms). Il PF-EPSC dovrebbe mostrare una facilitazione dell'impulso accoppiato e un aumento graduale dell'ampiezza rispetto all'aumento dell'intensità della stimolazione.
- Registrare la risposta al test del PF-EPSC applicando un singolo impulso a 0,1 Hz. Regolare l'intensità dello stimolo in modo che l'ampiezza dell'EPSC evocata sia di circa 200 pA. Evitare la contaminazione della corrente attraverso il canale ionico voltaggio-dipendente.
- Stimolare la FC nella parte inferiore dello strato cellulare di Purkinje e identificare l'EPSC suscitata dall'attivazione della FC (applicando uno stimolo a doppio impulso). La CF-EPSC dovrebbe mostrare una depressione a impulsi accoppiati e un modo tutto o niente in base all'aumento dell'intensità della stimolazione. Per l'induzione LTD, è necessario utilizzare un singolo stimolo.
- Protocollo che induce LTD 1
- Utilizzando un elettrodo contenente una soluzione interna a base di K+ in condizioni di pinza di corrente, applicare contemporaneamente un singolo stimolo PF e un singolo stimolo CF a 1 Hz per 5 minuti (300 impulsi) (Figura 1A).
- Protocollo di induzione LTD 2
- Utilizzando una soluzione interna a base di K+ contenente elettrodi in condizioni di pinza di corrente, applicare doppi stimoli PF (ISI di 50 ms) e un singolo stimolo CF poiché il secondo stimolo PF coincide con stimoli CF a 1 Hz per 5 minuti (Figura 1B).
- Protocollo di induzione LTD 3
- Utilizzando un elettrodo contenente una soluzione interna a base di Cs+ in condizioni di voltage-clamp, applicare un doppio stimolo PF (ISI di 50 ms) e un singolo gradino di tensione depolarizzante (da -70 a 0 mV, 50 ms) al soma a 1 Hz per 3 minuti, in modo che il secondo stimolo PF sia equivalente all'inizio del gradino di tensione depolarizzante (Figura 1C).
- Protocollo che induce LTD-4
- Utilizzando un elettrodo contenente una soluzione interna a base di Cs+ in condizioni di voltage-clamp, applicare contemporaneamente gli stimoli PF (5x a 100 Hz) e un singolo passo di tensione depolarizzante (da -70 a 0 mV, 50 ms) al soma a 0,5 Hz per 3 minuti (Figura 1D).
