Un modello in vitro per lo studio dell'attraversamento patogeno della barriera emato-encefalica e dell'infezione delle cellule cerebrali

Abstract

Fonte: da Costa, A., et al. Un modello di interfaccia sangue-cervello umano per studiare l'attraversamento delle barriere da parte di agenti patogeni o farmaci e le loro interazioni con il cervello. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video mostra un modello in vitro per studiare i patogeni che attraversano la barriera emato-encefalica (BEE). Le cellule endoteliali microvascolari, che esprimono giunzioni strette, formano uno strato endoteliale nella camera superiore, mentre i neuroni, gli astrociti e la microglia rappresentano il parenchima cerebrale nella camera inferiore, separati da una membrana porosa. L'infezione virale nel modello BBB imita l'agente patogeno che passa dal sangue al cervello. Dopo l'introduzione di un virus neurotropo, attraversa la BBB tramite transcitosi, infetta le cellule neurali, si replica e rilascia la progenie virale, dimostrando il successo della neuroinvasione.

Protocollo

1. Costruzione e controllo di qualità del BBB-Minibrain (Barriera ematoencefalica - Minibrain) (Figura 1)

1. Configurazione di un dispositivo di inserimento di coltura con membrana in poliestere BBB-Minibrain (Figura 1B)
   1. Far crescere la linea cellulare endoteliale del cervello umano (cellule hCMEC/D3) su filtri per colture a membrana in poliestere a 12 pozzetti per 6 giorni su terreno cellulare endoteliale prima di utilizzarli per l'esperimento.
   2. Rivestire una piastra a 12 pozzetti con poli-D-lisina (1 mL/pozzetto, 10 μg/mL, 4 ore a RT) e quindi laminina (1 mL/pozzetto, 1 μg/mL, durante la notte a RT).
   3. Rimuovere la laminina e aggiungere 1 mL di terreno di coltura delle cellule endoteliali integrato con il 5% di siero fetale bovino (FBS) (5% di terreno di coltura delle cellule endoteliali).
   4. Incubare per 1 ora a 37 °C, 5% CO₂ e 95% di umidità.
   5. Tripsinizzare delicatamente i neuroni umani post-mitotici (hNeurons) e gli astrociti umani (hAstrocytes) (NT2-N/A) e la linea cellulare microgliale umana (CHME/Cl5) e dissociare i pellet cellulari con il mezzo cellulare endoteliale completo.
   6. Contare le cellule, mescolare 3,6 x 10⁵ NT2-N/A e 0,4 x 10⁵ cellule/pozzetto e seminare la piastra a 12 pozzetti.
   7. A T=24 h (24 h dopo la semina): sostituire il terreno utilizzato con un terreno di coltura endoteliale completo fresco (cellule del minicervello e cellule endoteliali) e trasferire il filtro dell'inserto di coltura con membrana in poliestere hCMEC/D3 sulla parte superiore delle cellule del minicervello. Incubare il BBB-Minibrain a 37 °C, 5% di CO₂ e 95% di umidità.
      NOTA: Il BBB-Minibrain sarà quindi costituito da uno strato di cellule endoteliali umane hCMEC/D3 su filtro che isola il compartimento luminale (o compartimento "sangue") e da una coltura mista di cellule umane hNT2-N/A e hCHME/Cl5 (Minibrain) sul fondo del pozzetto che definisce il compartimento abluminale (o compartimento "cervello") (Figura 1B).
2. Validazione della permeabilità endoteliale del BBB-Minibrain (Controllo di Qualità) (Figura 1C)
   1. Preparare il tampone di trasporto (TB), che è il tampone HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) con Ca²⁺ e Mg²⁺ integrati con 10 mM di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanesolfonico (HEPES) e 1 mM di piruvato di sodio.
   2. Preparare piastre a 12 pozzetti con 1,5 mL di tampone di trasporto per pozzetto.
   3. A T= 0, preparare un nuovo tampone di trasporto integrato con 50 μM di Lucifer Yellow (LY-TB).
   4. Capovolgere ogni filtro per rimuovere con cura il mezzo senza intaccare la barriera cellulare endoteliale.
   5. Posizionare il filtro sulla piastra piena a 12 pozzetti e aggiungere 0,5 mL di LY-TB.
   6. Incubare le piastre in un incubatore a 37°C, 5% di CO₂ e 95% di umidità.
   7. A T=10 min trasferire i filtri su piastre da 12 pozzetti nuove riempite di TB e mantenere il compartimento abluminale della prima piastra per la lettura OD.
   8. A T= 25 min, ripetere il passaggio 1.2.7.
   9. A T= 45 min, interrompere il trasporto rimuovendo i filtri dalle piastre. Conservare gli scomparti abluminali e luminali per le misure OD.
   10. Trasferire i campioni in piastre scure a 96 pozzetti: 10 μL con 190 μL TB per il LY-TB e i compartimenti luminali, 200 μL di campione per i compartimenti abluminali.
   11. Misurare la fluorescenza del LY-TB presente nei diversi campioni a λ428 nm λ535 nm (rispettivamente onde di eccitazione e lunghezza di emissione).
   12. Calcola la permeabilità endoteliale (Pe) verso LY-TB (Pe_LY) utilizzando la formula:
       1/PSe= (1/PSt) – (1/PSf) e Pe_LY= PSe/S.
       NOTA: PSf è la permeabilità del filtro senza cellule, PSt è la permeabilità del filtro con le cellule, PSe è la permeabilità del monostrato endoteliale per la superficie del monostrato, S è la superficie del monostrato (per un filtro a 12 pozzetti=1,12 cm²), Pe_LY è espresso in cm/min. Per hCMEC/D3 il Pe_LY dovrebbe essere compreso tra 0,7 e 1,2 x 10^-3 cm/min a seconda principalmente dell'FBS utilizzato negli esperimenti. Importante: un Pe_LY superiore a 1,2 significa che la BBB non è abbastanza stretta e si possono osservare alcune perdite. Scarta queste barriere.

2. Uso di BBB-Minibrain per evidenziare la presenza di particelle virali neuro-invasive in un campione di vaccino contro il virus della febbre gialla, il virus neurotropo francese, YFV-FNV 34 (Figura 2)

1. Attraversamento della BBB e moltiplicazione dei virus della febbre gialla nel Minibrain
   1. Utilizzare il BBB-Minibrain preparato come descritto al punto 1.1.7 24 ore prima dell'aggiunta del virus; sostituire il terreno con il 2% di terreno di cellule endoteliali FBS.
      NOTA: È estremamente importante evitare di cambiare il supporto appena prima di aggiungere il virus. La modifica del terreno può attivare le cellule endoteliali umane e aprire transitoriamente la barriera che consentirà il passaggio del virus. Qui il mezzo viene cambiato 24 ore prima di iniziare l'esperimento.
   2. A T= 0, aggiungere con molta attenzione 3500 unità formanti placche (PFU) di YFV-FNV diluite in 50 μl di terreno cellulare endoteliale FBS al 2% sulla parte superiore del compartimento luminale. Il BBB-Minibrain di controllo viene inoculato con 50 μL di terreno cellulare endoteliale FBS al 2% senza virus. Determina Pe_LY sul compagno bene.
   3. Incubare il BBB-Minibrain in un incubatore a 37 °C, 5% di CO₂ e 95% di umidità.
   4. Dopo 24 ore, rimuovere il dispositivo filtrante con inserti di coltura in membrana di poliestere e determinare Pe_LY, campionare 1 mL dal compartimento abluminale e titolare il virus. Sostituire il terreno con un terreno di coltura endoteliale FBS fresco al 2%.
   5. Incubare il BBB-Minibrain a 37 °C, 5% di CO₂ e 95% di umidità.
   6. Dopo 72 ore, prelevare il terreno dal compartimento abluminale e titolare il virus e/o estrarre l'RNA dalle cellule del miniencefalo per l'analisi dell'espressione genica.

Risultati

Figura 1: il modello BBB-Minibrain. A. Cronoprogramma delle colture hCMEC/D3 e fotografia del dispositivo BBB-Minibrain: un inserto-filtro di coltura con membrana in poliestere con barriera endoteliale hCMEC/D3 viene tenuto con una pinza prima di essere inserito in un pozzetto di una piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti. B. Cartone animato che descrive il dispositivo con il com...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastre da 12 pozzetti	Corning	3336
Piastra di Petri da 85 mm	Sarstedt	83-3902-500
CHME/CL5	Unité de Neuroimmunologie Virale	Su richiesta al Dr. Lafon
CMC	Calbiochem	217274
Piastre scure a 96 pozzetti	Corning	3915
DMEM F12	Thermofisher Scientific	31330-038
DMSO	Merck-Sigma Aldrich	D2650
Endogro IV	Millipore	SCME004
Etanolo	Carlo Erba	529121
FBS	Hyclone	SV30015-04	Terreno cellulare endoteliale
HBSS con Ca2+-Mg2+	Thermofisher Scientific	14025-100
hCMEC/D3	Cedarlane	CLU512
Hepes 1M	Thermofisher Scientific	15630-070
Laminine	Merck-Sigma Aldrich	L6274
L-glutammina	Thermofisher Scientific	25030-024
Lucifero Giallo	Merck-Sigma Aldrich	L0259
MEM 10X	Thermofisher Scientific	21430
MEM 1X	Thermofisher Scientific	42360
Ntera/Cl2D.1	ATCC	CRL-1973
Paraformaldeide	Scienze della microscopia elettronica	15714
PBS senza Ca2+-Mg2+	Thermofisher Scientific	14190
PBS-Ca2+-MG2+	Thermofisher Scientific	14040-091
Penna/Strepto	Eurobio	CXXPES00-07
Poli-D-Lisina	Merck-Sigma Aldrich	P1149
Prolungare l'oro	Thermofisher Scientific	P36930
Kit di purificazione dell'RNA	QIAGEN	74104
Bicarbonato di sodio 5,6%	Eurobio	CXXBIC00-07
Piruvato di sodio	Thermofisher Scientific	11360
Pallone T75 Cell+	Sarstedt	83-1813-302	Pallone di polistirene per colture tissutali con trattamento superficiale specifico (Cell+) per cellule aderenti sensibili
Transwell	Corning	3460	Inserti di coltura con membrana porosa in poliestere
Tripsina-EDTA	Merck-Sigma Aldrich	T3924
Acqua ultra pura	Thermofisher Scientific	10977-035
Versene	Thermofisher Scientific	15040-033	EDTA
YFV-FNV	IP Dakar	Fiala di vaccino