1. Preparare le mosche per gli esperimenti MultiColor FlpOut (MCFO)
NOTA: La tecnica MCFO si riferisce a una versione modificata della cosiddetta escissione a cassetta di arresto mediata da Flp (FlpOut). I moscerini MCFO transgenici trasportano un promotore dello shock termico (hsp)-Flp ricombinasi e diversi reporter sotto il controllo della sequenza di attivazione a monte (UAS). Ogni reporter è costituito da una spina dorsale comune di una proteina fluorescente verde miristoilata (myr) super folder (sfGFP), in cui sono state inserite 10 copie di un tag epitopico (ad esempio, HA, FLAG o V5). Le proteine non fluorescenti risultanti sono denominate "spaghetti monster GFPs" (smGFPs) e possono essere rilevate utilizzando anticorpi specifici contro i diversi tag epitopi.
- Incrocia le mosche con la cassetta MCFO e l'hsp-Flp (hsp-Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) alle linee di driver GAL4 gliali appropriate (vedi Tabella dei materiali).
- Poiché l'hsp è già attivo a 25 °C e poche celle possono subire ricombinazione, portando ad una marcatura non specifica, impostare delle croci a 18 °C per evitare perdite nel sistema. Attendere circa 20 giorni a 18 °C per ottenere la generazione F1. Dopo lo shock termico (vedi passaggio 2), mantenere le mosche a 25 °C (Figura 1).
2. Shock termico
NOTA: A seconda del sito di inserimento, l'efficienza dell'hsp-Flp può differire; pertanto, il tempo ottimale di shock termico deve essere ottimizzato. Per questo protocollo, è stato utilizzato un ceppo mosca MCFO in cui l'hsp-Flp è stato inserito sul cromosoma X (vedi Tabella dei materiali).
- Trasferire la progenie dell'incrocio al punto 1.1 (mosche della generazione F1, di 3-4 giorni) in nuove fiale contenenti cibo e farle scaldare a 37 °C in un bagno d'acqua.
nota: Le mosche giovani (1-2 giorni di età) sono molto sensibili allo shock termico. Attendere 1 o 2 giorni in più prima di eseguire lo shock termico al fine di ridurre il tasso di mortalità causato dal trattamento. Usa alcune mosche della generazione F1 come controllo, senza shock termici.
- Durante lo shock termico, mantenere le mosche in fiale normali con il cibo per ridurre il tasso di mortalità indotta dallo stress. Mettere le femmine e i maschi in fiale separate.
- Assicurarsi di immergere l'intera fiala nell'acqua per garantire uno shock termico omogeneo. Utilizzare uno shock di 5-8 minuti come punto di partenza adatto per la marcatura sparsa di cellule gliali con molte linee driver GAL4; La durata dello shock deve essere ottimizzata per ogni driver ed esperimento (potrebbero essere necessari tempi di shock termico più brevi o più lunghi).
- Dopo lo shock termico, adagiare le fiale orizzontalmente sul banco per alcuni minuti in modo da permettere alle mosche di riprendersi dallo shock termico.
nota: Non è necessario cambiare le fiale.
- Mantenere le mosche a 25 °C e sezionarle (vedi passaggi 3 e 4) 2 o più giorni dopo lo shock termico per un'espressione reporter ottimale.
3. Preparazione e soluzioni per la dissezione
- Il giorno della dissezione, preparare una soluzione fissativa fresca in provette PCR da 200 μL mescolando 180 μL di terreno di coltura cellulare S2 con 20 μL di paraformaldeide (PFA) al 20% per ottenere una soluzione di PFA al 2%. Mantenere la soluzione fissativa sul ghiaccio prima e durante la dissezione.
cautela: Il PFA è tossico e deve essere maneggiato con cura.
nota: Miscelare 160 μl di terreno di coltura cellulare S2 con 40 μl di paraformaldeide (PFA) al 20% in una provetta con reazione a catena della polimerasi (PCR) da 200 μl per preparare una soluzione di PFA al 4% anziché al 2%.
- Utilizzare una provetta PCR per genotipo con un massimo di 8-10 cervelli per provetta per ottenere risultati di colorazione ottimali.
- Preparare la soluzione per il lavaggio del cervello adulto: 0,5% di albumina sierica bovina, 0,5% di Triton X-100 in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
NOTA: A seconda della colorazione, potrebbe essere necessaria una soluzione contenente l'1% di Triton X-100. Una maggiore concentrazione di Triton X-100 aumenta la penetrazione dell'anticorpo nel tessuto ed è necessario colorare le regioni che si trovano in profondità all'interno del tessuto (ad esempio, le regioni sinaptiche nel cervello adulto di Drosophila).
- Preparare la soluzione bloccante: 3% di siero normale di capra, 3% di siero d'asino normale e 0,5% di Triton X-100 in PBS.
- La soluzione per il lavaggio del cervello adulto e la soluzione bloccante possono essere conservate a 4 °C per alcune settimane.
- Mettere la lastra di vetro dei pozzetti a depressione profonda sul ghiaccio e riempire ogni pozzetto con le seguenti soluzioni: una con etanolo al 70%, una con PBS e una con terreno di coltura cellulare S2.
4. Dissezione cerebrale adulta
- Posizionare un piatto da dissezione di 3 cm sul tavolino di uno stereomicroscopio e riempirlo con terreno di coltura cellulare S2 freddo. Condurre tutte le dissezioni in questo mezzo per garantire che il tessuto rimanga sano durante la procedura di dissezione.
nota: Utilizzare un piatto da dissezione rivestito con diversi millimetri di silicone nero che fornisce un buon contrasto di fondo (nelle immagini) e conservare la pinza durante la dissezione.
- Anestetizzare i moscerini del genotipo desiderato con CO2.
- Con una pinza, afferrare la mosca per le ali e lavarla in etanolo freddo al 70% per 30 s, quindi con PBS freddo per altri 30 s.
- Trasferire la mosca nel pozzetto di depressione profonda che viene riempito con terreno di coltura cellulare S2.
- Ripetere la stessa procedura per tutte le mosche dello stesso genotipo e mantenerle in terreno di coltura cellulare S2 freddo fino alla dissezione, che preserverà il tessuto><.
nota: Anestetizzare solo il numero di mosche che possono essere sezionate in un periodo di tempo di circa 30 minuti. Lunghi tempi di incubazione nel terreno di coltura cellulare S2 possono danneggiare il tessuto.
- Afferrare la mosca con una pinza e, sotto uno stereomicroscopio, immergerla in un terreno di coltura cellulare S2.
- Staccare la testa dal resto del corpo. Scartare il corpo e tenere la testa immersa nel terreno di coltura cellulare S2. È estremamente importante tenere la testa con una pinza per tutta la durata della dissezione. Se la testina inizia a galleggiare, sarà difficile recuperarla senza danneggiare il tessuto.
- Inizia la dissezione estraendo un occhio, tenendo sempre la testa con almeno una pinza. Assicurati che la punta della pinza sia appena sotto la retina per evitare di danneggiare il tessuto sottostante. Estrai l'altro occhio e inizia a rimuovere la cuticola fino a quando non appare il cervello.
- Rimuovere tutto il tessuto tracheale e la cuticola intorno al cervello fino a quando il tessuto non appare pulito. Assicurati di rimuovere tutto il tessuto tracheale intorno al cervello per ottenere risultati di colorazione ottimali; I tessuti sono ora pronti per essere fissati e colorati.
- Mantenere tutti i cervelli sezionati in un terreno di coltura cellulare S2 freddo prima di trasferirli nella soluzione di PFA per cronometrare la fase di fissazione.
5. Colorazione del cervello adulto
- Trasferire il cervello isolato con una pipetta P10 nella soluzione di PFA a temperatura ambiente (RT). Per evitare danni ai tessuti, non usare mai pinze per trasferire il cervello dopo la dissezione. Eseguire tutti i passaggi in provette PCR da 200 μL su un nutatore.
- Per tutti i passaggi, prima di scartare la vecchia soluzione con una pipetta P200, lasciare che il cervello si depositi sul fondo della provetta. Prova a rimuovere il surnatante senza aspirare il tessuto. Proteggere il tessuto dall'esposizione alla luce.
- Fissare il cervello in 200 μL di PFA al 2% in terreno di coltura cellulare S2 per 1 ora o in PFA al 4% per 30 minuti. Mantenere identici i tempi di fissazione tra i campioni per aumentare la riproducibilità.
- Dopo 3 (o più) lavaggi di 15 minuti ciascuno in 200 μL di soluzione per il lavaggio del cervello adulto, bloccare i tessuti con 200 μL di soluzione bloccante per 30 minuti. Sono possibili tempi di incubazione più lunghi in soluzione bloccante.
- Incubare il cervello per una notte a 4 °C con anticorpi primari diluiti in una soluzione di lavaggio del cervello adulto in un volume totale di 200 μL.
nota: I tempi di incubazione possono variare a seconda del tipo di anticorpo utilizzato. Potrebbero essere necessarie incubazioni più lunghe.
- Per la marcatura dei tre marcatori MCFO, incubare il cervello con anticorpi primari anti-HA (1:500), anti-FLAG (epitopo DYKDDDDK) (1:100) e anti-V5.
- Gli anticorpi primari coniugati direttamente potrebbero essere utilizzati al posto della normale combinazione primaria + secondaria (ad esempio, anti-V5:DyLight 549 (1:200)). In questo caso, trattare gli anticorpi coniugati direttamente come anticorpi secondari.
nota: Per ogni genotipo, tenere alcuni cervelli come controlli per verificare la specificità della colorazione. Salta l'incubazione degli anticorpi primari e vai direttamente alla fase successiva.
- Lavare i tessuti 3 volte per 1 ora in 200 μL di soluzione per il lavaggio del cervello adulto (fase 3.3) e incubarli con fluorofori coniugati secondari/anticorpi primari direttamente coniugati diluiti in soluzione per il lavaggio del cervello adulto per una notte a 4 °C o per 4 ore a RT, in un volume totale di 200 μL
nota: Esempi di anticorpi appropriati: AlexaFluor 488 (1:250), anticorpi coniugati anti-V5:DyLight 549 (1:200) e DyLight 647 (1:100).
- Lavare il cervello 3 volte per 1 ora in 200 μL di soluzione per il lavaggio del cervello adulto, seguito da un lavaggio finale in 200 μL di PBS durante la notte a 4 °C o per 1-2 ore in RT; la fase finale di lavaggio in PBS rimuove qualsiasi traccia di Triton X-100 ed è necessaria per ottenere risultati di colorazione ottimali. Montare i cervelli in mezzo di montaggio con un agente anti-sbiadimento sui vetrini coprioggetti.
6. Montaggio di cervelli per l'imaging
- Taglia un distanziatore di immagini alla dimensione appropriata usando le forbici. Per la microscopia ad alta risoluzione, inserire il campione e il distanziatore di imaging tra due vetrini coprioggetti.
nota: I distanziatori per immagini sono distanziatori adesivi sottili (0,12 mm di spessore) che si staccano e si attaccano ai vetrini coprioggetti o ai vetrini del microscopio, consentendo il montaggio di campioni senza compressione.
- Utilizzando una pinza, rimuovere il rivestimento adesivo da una superficie e applicare il distanziatore, con il lato adesivo rivolto verso il basso, sulla superficie di un vetrino coprioggetti in vetro (22 mm x 60 mm). Applicare 10 μl di terreno di montaggio su un nuovo vetrino coprioggetti.
- Con una pipetta P10, trasferire i cervelli dalla provetta da 200 μl al vetrino coprioggetti, accanto alla goccia di terreno di montaggio. Insieme ai tessuti, trasferire un po' di PBS per mantenere il cervello in soluzione.
- Con una pipetta P10, spostare il cervello dal PBS alla goccia del mezzo di montaggio cercando di limitare la quantità di PBS. Trasferire i campioni nel mezzo di montaggio sul vetrino coprioggetti con il distanziatore di imaging. Utilizzare una quantità sufficiente di materiale di montaggio per coprire il campione.
- Rimuovere l'altro rivestimento adesivo dal lato superiore del distanziatore e aggiungere un vetrino coprioggetti in vetro sopra i campioni. Con la punta di una pinza, applicare una leggera pressione sull'area adesiva per sigillare. Eseguire immediatamente l'imaging dei tessuti montati o conservare i vetrini a -20 °C per un'analisi successiva.
