Una tecnica di ablazione stereotassicamente guidata per la rimozione della corteccia uditiva nei ratti

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione del Topo

NOTA: Abbiamo eseguito gli esperimenti su ratti maschi per evitare qualsiasi cambiamento ormonale.

1. Anestetizzare l'animale utilizzando una miscela di ketamina cloridrato (30 mg/kg) e xilazina cloridrato (5 mg/kg) iniettata per via intramuscolare; con questa dose, il ratto deve essere anestetizzato profondamente per circa 1 ora.
2. Pizzica l'alluce del ratto; l'assenza di un riflesso di ritiro indica che l'animale è completamente incosciente. Se il ratto risponde al pizzicotto, somministrare un'anestesia supplementare a un terzo della dose iniziale.
3. Radere il cuoio capelluto e disinfettare l'area chirurgica con iodio povidone.
4. Posizionare l'animale su un termoforo per mantenere una temperatura di 38 °C e stabilizzare la testa dell'animale in un telaio stereotassico utilizzando due barre auricolari e una barra per morsi. Prestare attenzione per evitare di perforare la membrana timpanica con le barre auricolari.
5. Proteggi gli occhi applicando una goccia di gel oftalmico o siero salino su ciascun occhio.

2. Posizione dell'AC nell'osso temporale del ratto

1. Usando un bisturi, praticare un'incisione lungo la linea mediana per esporre il cranio e ritrarre il periostio che copre la superficie del cranio.
2. Utilizzare una punta di cotone sterile per rimuovere delicatamente il sangue che copre la superficie del cranio per visualizzare bregma, lambda e 0 interaurale secondo l'atlante di Paxinos e Watson del cervello di ratto.
3. Praticare un'incisione nel muscolo temporale vicino alla sua inserzione dorsale sul cranio con un bisturi. Estrarre il muscolo utilizzando un ago e un materiale di sutura e fissare il materiale di sutura al telaio stereotassico; Questo esporrà l'osso temporale. In caso di sanguinamento, sciacquare con soluzione fisiologica sterile fredda.
4. Posizionare un ago dritto sterile nel micromanipolatore stereotassico, assicurandosi che sia completamente fissato.
5. Abbassa lentamente l'ago fino a quando non si trova proprio sopra la superficie del cranio, in modo che la punta dell'ago sia impostata su 0 interaurale. Impostate questo punto su zero e determinate le coordinate da questo punto.
6. A seconda dell'area cerebrale di interesse, variare le coordinate stereotassiche. Determina queste coordinate utilizzando l'atlante di Paxinos e Watson del cervello di ratto. Una volta determinate le coordinate, sposta l'ago in modo che corrisponda a tali coordinate.
7. Puntare l'AC utilizzando le coordinate dei seguenti quattro punti: A: anteroposteriore (A/P) = -5,8 mm, mediolaterale (M/L) = +/- 6,4 mm; B: A/P= -2,7 mm, M/L= +/- 6,4 mm; C: A/P= -2,7 mm, M/L= +/- 8,67 mm; D: A/P= -5,8 mm, M/L= +/- 8,67 mm. Abbassa l'ago proprio sopra l'osso temporale per visualizzare ciascuno di questi quattro punti. Usando un pennarello, segna i punti sull'osso temporale e collegali in modo da disegnare un rettangolo; il rettangolo servirà come guida per l'apertura di una finestra nell'osso (Figura 1).

3. Esposizione chirurgica dell'AC

1. Aprire la finestra utilizzando un trapano elettrico e una punta piccola (0,6 mm Ø). Forare il perimetro del rettangolo a 8.000 giri/min fino a quando l'osso cede. Raffreddare la superficie di foratura risciacquando con soluzione fisiologica sterile fredda per evitare danni alle strutture sottocorticali. Quando l'osso cede, è possibile rilevare un calo di resistenza. Fai attenzione a non perforare il cervello.
2. Quando i bordi sono allentati, sollevare l'osso di copertura con una pinza fine e conservarlo in soluzione salina fredda e sterile.

4. Ablazione dell'AC

1. Utilizzando un microscopio operatorio (10X), tagliare delicatamente le meningi con un bisino microchirurgico e rimuoverle utilizzando due pinze a punta fine. In caso di sanguinamento, sciacquare con soluzione fisiologica sterile fredda.
2. Aspirare delicatamente l'AC utilizzando un dispositivo di aspirazione chirurgica (pressione -0,24 bar) accoppiato a un ago sterile a punta smussata da 20 G. Questo punto è critico e deve essere eseguito con molta attenzione: aspirare solo i sei strati corticali e non la sostanza bianca sottostante.
3. Aspirare fino a quando le arterie perforanti smettono di sanguinare.
4. Al termine dell'aspirazione, coprire la zona lesa con l'osso estratto e applicare una garza emostatica riassorbibile.
5. Lasciare che il muscolo temporale recuperi la sua posizione originale, quindi suturare la pelle utilizzando clip per ferite (9 mm). Applicare un unguento antibiotico. Continuare ad applicare l'unguento sulla ferita due volte al giorno per tre giorni.
   NOTA: Ogni applicazione è costituita da uno strato sottile applicato sulla ferita.
6. Iniettare buprenorfina per via sottocutanea nella parte posteriore del ratto (0,05 mg/kg) come analgesico 1 ora dopo l'intervento chirurgico e poi ogni 8 ore per 72 ore.
7. Tieni l'animale sul termoforo fino a quando non si sveglia e rimettilo nella sua gabbia di alloggiamento per riprendersi.

Figura 1: Immagini dell'osso temporale del ratto in tre diverse fasi chirurgiche. (A) Trasferimento delle coordinate stereotassiche dell'AC all'osso temporale. Le coordinate dei quattro punti sono: A: A/P= -5,8 mm, M/L= +/- 6,4 mm; B: A/P= -2,7 mm, M/L= +/- 6,4 mm; C: A/P= -2,7 mm, M/L= +/- 8,67 mm; D: A/P= -5,8 mm, M/L= +/- 8,67 mm. (B) Le coordinate vengono utilizzate come riferimento per disegnare un rettangolo sulla superficie dell'osso temporale che guiderà l'apertura di una finestra. (C) Mostra la finestra aperta nell'osso dopo la perforazione. Le meningi con vasi sanguigni possono essere osservate sulla superficie del cervello. R: rostrale, D: dorsale.