Giorno 1
1. Marcatura dei mitocondri delle cellule staminali mesenchimali (MSC)
- Due giorni prima della preparazione dei mitocondri, seminare le MSC umane in una piastra cultAure da 100 mm, in 10 ml (Minimum Essential Medium Eagle)/FBS (Fetal bovine serum) 10%, in modo da avere 4 x 105 MSC in coltura il giorno 1.
- Sciacquare le MSC con PBS (4 ml) e aggiungere 4 ml di αMEM/FBS 1% (preriscaldato a 37 °C).
- Aggiungere la quantità necessaria di colorante vitale per mitocondri e incubare le cellule per 30 minuti nell'incubatore a 37 °C.
- Rimuovere la soluzione colorante per mitocondri, sciacquare due volte le cellule con 4 ml di αMEM/FBS 1% preriscaldato (37 °C) e aggiungere nuovamente 4 ml di αMEM/FBS 10%. Incubare le cellule a 37 °C.
- Cambiare il terreno di coltura (10 ml αMEM/FBS 10%) dopo 30 minuti e, un'altra volta, 2 ore dopo.
Giorno 1
2. Etichettatura delle cellule staminali del glioblastoma (GSC)
- Linea cellulare dissociata di GSCs Gb4 (10 x 106 cellule) cresciuta come neurosfere su fiasche di coltura cellulare rivestite di poli-HEMA
- Semina di GSC in una piastra a 48 pozzetti a 105 cellule/pozzetto in terreno di proliferazione GSC (500 μl) (vedi Tabella 1).
- Centrifugare la piastra a 270 x g per 5 minuti a 20 °C.
- Aggiungere la quantità necessaria di colorante vitale cellulare e incubare per 30 minuti a 37 °C.
- Aggiungere 500 μl di terreno basale GSC (Tabella 1) per pozzetto della piastra a 48 pozzetti.
- Centrifugare la piastra a 270 x g a 20 °C per 5 min. Aspirare il surnatante.
- Ripetere i passaggi da 2.5 a 2.6.
- Aggiungere 500 μl di terreno basale GSC e incubare a 37 °C per 30 minuti.
- Centrifugare la piastra a 270 x g a 20 °C per 5 min. Aspirare il surnatante.
- Aggiungere 500 μl di terreno di proliferazione GSC per pozzetto della piastra a 48 pozzetti e incubare nell'incubatore a 37 °C.
nota: La quantità di GSC indicata (10 x 106 cellule) consente di eseguire i diversi esperimenti dose-risposta e i controlli FACS. Una volta definite con maggiore precisione le condizioni sperimentali, questa quantità può essere ridotta.
3. Semina di cellule staminali di glioblastoma
- Raccogliere le neurosfere GSC (Glioblastoma stem cells) (10 x 106 cellule) mediante centrifugazione a 270 x g per 5 min, a 20 °C in una provetta da 50 ml.
- Lavare le celle con 5 ml di HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) e centrifugare a 270 x g per 5 minuti a 20 °C.
- Aspirare il surnatante.
- Risospendere delicatamente il pellet GSC in 100 μl di tripsina-EDTA (acido etilendiammina tetraacetico) (0,25%) (per 10 x 106 cellule)
- Incubare a 37 °C per 3 min.
- Aggiungere 10 μl di CaCl2 (20 mM) e 2 μl di DNasi I (10 mg/ml).
- Dissociare le neurosfere pipettando delicatamente su e giù (30-50x) con una pipetta P200. Evita le bolle. Controllare al microscopio che tutte le GSC siano dissociate.
- Aggiungere 10 μl di inibitore della tripsina (5%) e 10 ml di HBSS.
- Centrifugare le GSC a 270 x g per 7 min a 20 °C.
- Scartare il surnatante e aggiungere 10 ml di terreno basale GSC.
- Contare le GSC con una camera di conteggio Thoma e centrifugare le cellule a 270 x g per 7 minuti a 20 °C.
- Aggiungere il volume appropriato di terreno di proliferazione delle GSC per raggiungere la concentrazione cellulare di10-6 GSC/ml.
- Seminare10-5 GSC (100 μl di sospensione cellulare) per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
- Centrifugare le piastre a 270 x g per 7 minuti a 20 °C per ottenere le GSC sul fondo dei pozzetti.
- Incubare la piastra a 96 pozzetti a 37 °C.
Giorno 2
4. Isolamento dei mitocondri delle MSC (cellule staminali mesenchimali)
- Regolare la temperatura della centrifuga per microprovette a 4 °C.
- Preparare due provette da 1,5 ml "A" e "C" contenenti i reagenti per l'estrazione dei mitocondri (200 μl di reagente A e 400 μl di reagente C, entrambi contenenti gli inibitori della proteasi EDTA-free). Preparare altre 2 provette, etichettate "MSC" e "Mito". Tenere tutti i tubi sul ghiaccio. Preparare anche le provette per le diluizioni seriali dei mitocondri.
- Lavare le MSC con 10 ml di PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) preriscaldato (37 °C).
- Lavare le MSC con 2 ml di tripsina (senza EDTA) per 10 secondi e aggiungere 1 ml di tripsina (senza EDTA). Incubare le cellule per 5-10 minuti a 37 °C.
- Recuperare le MSC aggiungendo 10 ml di αMEM/FBS 10%, trasferire in una provetta da 50 ml.
- Centrifugare le celle a 270 x g per 5 minuti a 20 °C.
- Scartare il surnatante e aggiungere 10 ml di αMEM/FBS 10% al pellet cellulare.
- Contare le MSC con una camera di conteggio Malassez.
- Centrifugare MSC (4-5 x 105) a 270 x g per 5 min a 20 °C.
- Scartare il surnatante, aggiungere 1 m di αMEM/FBS 10% ghiacciato al pellet cellulare e trasferire le cellule nella provetta marcata con "MSC". Mantieni il tubo sul ghiaccio.
- Centrifugare la provetta contenente le MSC a 900 x g per 5 minuti, a 4 °C.
- Rimuovere tutto il fluido residuo dal tubo.
- Aggiungere 200 μl di reagente A per l'isolamento dei mitocondri (contenente gli inibitori della proteasi esenti da EDTA). Vorticare a velocità media per 5 secondi e lasciare i tubi sul ghiaccio per 2 minuti esatti.
- Aggiungere 2,5 μl di reagente di isolamento dei mitocondri B. Agitare alla massima velocità per 10 secondi, quindi lasciare le provette sul ghiaccio. Ripetere ogni 30 secondi per 5 minuti.
- Aggiungere 200 μl di reagente C per l'isolamento dei mitocondri (contenente gli inibitori della proteasi esenti da EDTA). Mescolare inclinando il tubo (circa 30 volte, senza vortici). Centrifugare la provetta a 700 x g per 10 minuti a 4 °C.
- Trasferire il surnatante (contenente i mitocondri MSC) nella provetta "Mito".
- Centrifugare a 3.000 x g, 15 min a 4 °C, per ottenere il pellet di mitocondri. Scartare il surnatante. Il pellet contiene i mitocondri isolati.
- Sciacquare il pellet dei mitocondri con 200 μl del reagente C. Quindi, centrifugare a 12.000 x g, 5 minuti a 4 °C, per ottenere il pellet di mitocondri.
5. Trasferimento di mitocondri MSC isolati a GSC (MitoCeption)
- Aggiungere 200 μl del terreno di proliferazione GSC preraffreddato (0 °C) al pellet di mitocondri isolato dalle MSC (4 x 105).
- Diluire la preparazione mitocondriale (nel mezzo di proliferazione delle GSC) per aggiungere costantemente 20 μl di sospensione mitocondriale alle GSC.
- Aggiungere il volume dei mitocondri isolati nei pozzetti della piastra a 96 pozzetti contenente le GSC, alla concentrazione desiderata (da 0,1 a 10 μg). Aggiungere i mitocondri lentamente, vicino al fondo della fontana, coprendo almeno una volta tutta la superficie.
- Centrifugare la piastra a 96 pozzetti contenente le GSC riceventi dei mitocondri con i mitocondri MSC e la piastra di controllo a 1.500 x g per 15 minuti a 4 °C.
- Posizionare le piastre di coltura nell'incubatore cellulare a 37 °C subito dopo la centrifugazione.
nota: Il protocollo di trasferimento dei mitocondri si basa sulla centrifugazione della sospensione mitocondriale sulle cellule in coltura alla forza di centrifugazione adeguata, con un numero di centrifugazioni che può essere regolato a seconda del sistema di cellule donatrici/riceventi dei mitocondri.
Tabella 1: Media culturali.
| Terreno di coltura cellulare | composizione |
| GSC medio basale | DMEM/F-12 integrato con |
| Insulina 20 mg/ml |
| Supplemento N2 1x |
| Glucosio 3 g/L |
| L-glutammina 2 mM |
| GSC mezzo di proliferazione | Aggiungere al terreno basale: |
| Supplemento B27 1x |
| EGF 10 ng/ml |
| bFGF 10 ng/ml |
| Fungina 10 mg/ml |
| Fungizone 0,25 mg/ml |
| Eparina 2 mg/ml |
| Ciprofloxacina 2 μg/ml |
| Gentamicina 2 μg/ml |
| Mezzo di proliferazione MSC | αMEM integrato con |
| L-glutammina 2 mM |
| 10% FBS |
| bFGF 2 ng/ml |
