Colorazione a fluorescenza di cellule di cresta neurale coltivate su idrogel di rigidità variabile

Abstract

Fonte: Le, T. P., et al., Un sistema O9-1/idrogel ottimizzato per lo studio di segnali meccanici nelle cellule di cresta neurale. J. Vis. Exp. (2021)

In questo video, descriviamo la procedura per eseguire la colorazione a fluorescenza utilizzando la microscopia a fluorescenza per dimostrare la colorazione della falloidina delle cellule della cresta neurale coltivate su idrogel di rigidità variabile per visualizzare e analizzare l'organizzazione del citoscheletro.

Protocollo

1. Analisi molecolare della rigidità tramite colorazione in immunofluorescenza

1. Utilizzare le pinzette per trasportare il vetrino coprioggetti su una nuova piastra per ridurre al minimo i falsi segnali provenienti dalle cellule cresciute direttamente sulla piastra. Lavare le cellule con 500 μl di PBS sterile tre volte per rimuovere le cellule morte e l'eventuale terreno di coltura rimanente.
2. Fissare le celle utilizzando indisturbato 500 μL di paraformaldeide (PFA) al 4% per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi, rilavare le cellule tre volte utilizzando 500 μL di PBS/pozzetto per 2 minuti ciascuna.
   NOTA: Conservare a 4 °C per l'arresto procedurale.
3. Trattare le cellule con 500 μl di Triton X-100 allo 0,1% per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi, lavare le cellule tre volte con 500 μL di PBS/pozzetto.
4. Bloccare le cellule con 250 μL di siero d'asino al 10% (diluito in PBS e 0,1% Tween 20) per pozzetto per 30 minuti a temperatura ambiente.
5. Incubare le cellule con falloidina utilizzata per la colorazione con F-actina ad una diluizione di 1:400 in 250 μL di siero d'asina al 10% per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi, lavare le celle tre volte con PBS per 5 minuti ciascuna.
   NOTA: La falloidina a 568 nm può essere co-incubata con anticorpi secondari a 488 nm o 647 nm o da sola.
6. Incubare le cellule con 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, diluizione 1:1000) in 250 μL di PBS per 10 minuti seguito da un ultimo lavaggio di PBS per 2 minuti.
7. Aggiungere 3-4 gocce di terreno di montaggio a ciascun pozzetto. Conservare i campioni a 4 °C per almeno 2 ore prima dell'imaging per assicurarsi che il mezzo di montaggio sia stato impostato correttamente.
8. Con un microscopio a fluorescenza, è possibile acquisire immagini di almeno 3 fotogrammi casuali per campione di idrogel, producendo canali singoli e uniti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2 mm #1 Corning 0211 Vetrino coprioggetti	Chemglass Scienze della Vita	CLS-1763-012
25 mm #1 Corning 0211 Vetrino coprioggetti	Chemglass Scienze della Vita	CLS-1763-025
Piastra per colture cellulari a 4 pozzetti	Thermo Scientific	179830
4% Paraformaldeide	Sigma Aldrich	J61899-AP
40% acrilammide	Sigma Aldrich	A4058
Alexa Fluor 488 falloidina	Thermo Fisher	A12379
Collagene di tipo I (100mg)	Corning	354236
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindolo, dicloridrato)	Thermo Fisher	D1306
Siero d'asino	Sigma Aldrich	D9663
Sterile 1x PBS	Hyclone	SH30256.02
Microscopio a fluorescenza	Leica