$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Preparazione delle soluzioni di lavoro e dei buffer
NOTA: La mattina del test, prepara le seguenti soluzioni. Questo calcolo si basa sulle soluzioni necessarie per elaborare due regioni del cervello (cioè la corteccia prefrontale [PFC] e l'ippocampo [HPC]) da 12 topi.
- Preparare il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF, pH = 7,4) come indicato nella Tabella 1. Erogare 750 μl di aCSF in ciascuna provetta di campionamento e posizionarli nel blocco di temperatura metallico su ghiaccio per pre-raffreddare il tampone.
- Preparare il tampone di lisi come indicato nella Tabella 2. Conservare in ghiaccio (400 μl da utilizzare per campione).
- Preparare 52 mM di Bis(sulfosuccinimidil)suberato o una soluzione madre BS3 (26x) in 5 mM di tampone citrato di sodio (pH = 5,0).
- Innanzitutto, preparare 100 mM di acido citrico (stock A) e 100 mM di citrato di sodio (stock B).
- Diluire il materiale A e il materiale B in rapporto 1:20 con acqua deionizzata. Aggiungere 100 μl ciascuno a 1,9 mL di acqua per preparare rispettivamente 5 mM di acido citrico (stock C) e 5 mM di citrato di sodio (stock D).
- Miscelare 410 μL di stock C e 590 μL di stock D per preparare un tampone citrato di sodio 5 mM (pH = 5,0) (soluzione E, 1 mL).
- Confermare il pH della soluzione E utilizzando una striscia indicatrice di pH.
- Sciogliere 24 mg di BS3 in 806,4 μL di soluzione E agitando per 30 s per preparare la soluzione madre di BS3 (26x).
- Preparare un altro 1 mL di soluzione E da utilizzare come controllo del veicolo per i campioni non reticolanti.
NOTA: Preparare la soluzione stock BS3 quando tutto il resto è pronto e l'esperimento sta per iniziare. Il BS3 deve essere conservato essiccato a 4 °C fino al momento dell'uso. Una volta ricostituito, BS3 rimane attivo solo per circa ≤3 ore. Poiché è noto che il pH del tampone citrato di sodio 5 mM (soluzione E) aumenta nel tempo, causando un'idrolisi accelerata di BS3, si raccomanda di preparare la soluzione E fresca dalle soluzioni madre A e B. A causa della limitata solubilità di BS3 a basse temperature, il BS3 ricostituito deve essere mantenuto a RT. Utilizzare il BS3 ricostituito entro 3 ore, e non congelare/scongelare o riutilizzare il BS3 ricostituito.
2. Dissezione dei tessuti cerebrali
NOTA: Da questo passo in poi, almeno due persone dovrebbero lavorare insieme in modo coordinato. Mentre una persona si concentra sulla dissezione animale, l'altra persona dovrebbe lavorare come cronometrista e aiutare a coordinare il test.
- Portare il primo animale per la dissezione dall'area di stabulazione alla sala di dissezione.
NOTA: Poiché i fattori di stress acuti (ad esempio, un nuovo ambiente, l'odore del sangue) possono influenzare la dinamica delle proteine cerebrali, gli animali devono essere tenuti nelle loro gabbie domestiche posizionate lontano dall'area di dissezione e poi essere portati individualmente nella stanza di dissezione per la decapitazione immediata.
- Eutanasia del topo mediante lussazione cervicale seguita da decapitazione. Estrarre rapidamente il cervello dal cranio e immergerlo in PBS ghiacciato in una capsula di Petri per 10-15 secondi (Figura 1).
NOTA: Gli animali non sono anestetizzati per gli esperimenti BS3 poiché qualsiasi agente anestetico potrebbe potenzialmente influenzare il livello di presentazione superficiale dei recettori dei neurotrasmettitori.
- Posizionare il cervello raffreddato nella matrice cerebrale sul ghiaccio, con il lato ventrale del cervello rivolto verso l'alto (Figura 2).
- Inserire la prima lama di rasoio attraverso il bordo tra il bulbo olfattivo e il peduncolo olfattivo per tagliare il cervello coronalmente (Figura 3). Utilizzando tre o quattro lame di rasoio aggiuntive, tagliare in serie la parte anteriore del cervello coronalmente con intervalli di 1 mm.
- Solleva le fette coronali dalla matrice cerebrale tenendo insieme tutte le lame di rasoio inserite, lasciando la parte posteriore del cervello dietro la matrice cerebrale. Usa una pinza per separare le lame del rasoio l'una dall'altra e posizionale sulla superficie piana e fredda con la fetta di cervello rivolta verso l'alto (Figura 4).
- Identificare le sezioni contenenti la regione di interesse. Per il campionamento della PFC, scegliere la seconda e la terza fetta posteriori alla prima fetta contenente il peduncolo olfattivo.
- Rimuovere la regione di interesse utilizzando un punzone per tessuti, metterla da parte sulla lama del rasoio raffreddata e dividere uniformemente il tessuto in due (ad esempio, tessuti dell'emisfero sinistro rispetto a quello destro, con una metà da utilizzare per la reazione di reticolazione BS3 e l'altra metà per il controllo senza reticolazione se la proteina bersaglio di interesse è espressa in modo uguale in entrambi gli emisferi).
- Tritare ogni fazzoletto in pezzi sulla lama del rasoio usando la punta sottile della pinza con più movimenti verticali contro la lama invece di schiacciare o macinare i tessuti. Ciò massimizzerà la superficie accessibile a BS3 senza compromettere gravemente l'integrità della membrana delle cellule. Subito dopo la macinazione, trasferire i fazzoletti macinati nelle apposite provette (vedere il passaggio 3.3).
3. Reazione di reticolazione
- Portare l'animale successivo per la dissezione dall'area di stabulazione alla sala di dissezione quando la dissezione del cervello del topo precedente sta per terminare (passaggio 2.10).
- Versare la provetta pre-raffreddata su ghiaccio con 30 μl di soluzione BS3 (26x) o di soluzione veicolare E subito prima che i tessuti tritati siano pronti per essere trasferiti nelle provette appropriate. Sostituire i puntali delle pipette tra le provette per assicurarsi che non vi siano sostanze contaminate da BS3 nelle provette di controllo senza reticolazione.
- Trasferire i tessuti tritati (dal passaggio 2.8) nelle provette appropriate, quindi iniziare a sezionare l'animale successivo (passaggio 2.2).
- Capovolgere e mescolare la provetta per rompere i pezzi di tessuto in pezzi più piccoli e iniziare a incubare i campioni sul rotatore di provette nella cella frigorifera per 30 minuti o 2 ore. Registrare l'ora di inizio dell'incubazione BS3 per ciascuna provetta. Vedere la sezione di discussione per il tempo di incubazione ottimale.
- Estinguere la reazione aggiungendo la provetta con 78 μl di glicina 1 M e incubare ulteriormente il campione per 10 minuti a 4 °C con rotazione costante. Registrare l'ora di inizio e fine della tempra per ogni tubo. Continua ad assistere la persona concentrandoti sulla dissezione dell'animale portando l'animale successivo (passaggio 3.1) e aiutandolo con la reticolazione (passaggio 3.2).
NOTA: Trattare ogni campione esattamente nello stesso momento su tutti i campioni. Se la sala di dissezione è lontana dalla cella frigorifera, si consiglia vivamente di reclutare una terza persona per partecipare all'incubazione del campione e alla tempra nella cella frigorifera.
Tabella 1: La composizione del liquido cerebrospinale artificiale.
| Lavoro conc. | Soluzione madre | Quantità di soluzione madre da erogare |
| 1,2 mM di CaCl2 | 480 mM (400x)* | 100 μl |
| 20 mM HEPES | 1 M (50x) | 800 μl |
| 147 mM di NaCl | 5 M (34x) | 1176,5 μl |
| 2,7 mM KCl | 1,08 m (400x) | 100 μl |
| 1 mM di MgCl2 | 400 mM (400x) | 100 μl |
| 10 mM di glucosio | 2,5 M (250x) | 160 μl |
| Acqua deionizzata | | 37.563 ml |
| totale | | 40 ml |
| * Il brodo di CaCl2 dovrebbe essere preparato al momento il giorno dell'esperimento. |
Tabella 2: La composizione del tampone di lisi
| Lavoro conc. | Soluzione madre | Quantità di soluzione madre da erogare |
| 25 mM HEPES | 1 M (40x) | 500 μl |
| 500 mM di NaCl | 5 M (10x) | 2 ml |
| 2 mM EDTA | 0,5 M (250x) | 80 μl |
| 1 mM DTT | 1 M (1000x) | 20 μl |
| 0,1% NP-40 | 10% (100x) | 200 μl |
| Cocktail di inibitori della proteasi | 100x | 200 μl |
| Acqua deionizzata | | 17 ml |
| totale | | 20 ml |
