Valutazione dell'assorbimento del glucosio nei motoneuroni delle larve di Drosophila con metabolismo del glucosio sovraregolato

In questo articolo

Abstract

Fonte: Loganathan, S., et al., Misurazione dell'assorbimento del glucosio nei modelli di Drosophila della proteinopatia TDP-43. J. Vis. Exp. (2021).

Il video mostra una tecnica per misurare l'assorbimento del glucosio nei motoneuroni larvali di Drosophila utilizzando un sensore di glucosio intracellulare basato sul trasferimento di energia per risonanza di fluorescenza (FRET). Dopo aver sezionato le larve per esporre il cordone nervoso ventrale, i motoneuroni vengono visualizzati attraverso la fluorescenza emessa dal fluoroforo donatore del sensore. Quando stimolato con glucosio, il FRET tra i fluorofori donatore e accettore del sensore innesca l'emissione di fluorescenza dall'accettore, consentendo il confronto dell'assorbimento di glucosio tra larve di controllo e larve mutanti con metabolismo del glucosio sovraregolato.

Protocollo

1. Drosophila Dissezioni del cordone nervoso ventrale (VNC)

Realizzare piatti di dissezione in elastomero siliconico.
1. Versare i componenti in elastomero siliconico in una provetta da 50 ml come indicato nel protocollo del produttore e mescolare bene.
2. Riempire piastre di coltura tissutale da 35 mm con circa 2 mL della miscela di elastomeri. Utilizzare una siringa per rimuovere eventuali bolle. Coprire i piatti e metterli su una superficie piana in forno a 60 °C per una notte per farli asciugare.
Sezionare larve di Drosophila per esporre il VNC mantenendo la vitalità tissutale.
1. Raccogliere una larva di terzo stadio errante, sciacquare con ddH₂O, quindi metterla in una goccia di tampone emolinfatico 3 (HL3) (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 10 mM NaHCO₃, 115 mM di saccarosio, 5 mM di trealosio, 5 mM di acido idrossietilpiperazina etano solfonico [HEPES]; pH 7,1) su un piatto rivestito di elastomero.
2. Usando un paio di pinze (#5 o 55 pinze) al microscopio da dissezione, appuntare le estremità anteriore e posteriore della larva con il lato dorsale rivolto verso l'alto, allungando accuratamente la larva nel senso della lunghezza con spilli per insetti (Minutein Pins).
3. Fai un'incisione appena sopra il perno posteriore usando un paio di forbici per iride angolate. Praticare un taglio verticale partendo dall'incisione verso l'estremità anteriore della larva.
4. Se necessario, aggiungere alcune gocce di tampone HL-3. Rimuovere la trachea e il resto degli organi galleggianti senza disturbare il sistema nervoso centrale (SNC). Fissare i lembi allungando la parete corporea per esporre il SNC mantenendo intatto il sistema neuromuscolare (VNC, assoni e giunzioni neuromuscolari).

2. Acquisizione delle immagini

Ottimizza i parametri di imaging.
1. Accendere il microscopio e i laser prima di iniziare le dissezioni. Le immagini devono essere acquisite utilizzando un microscopio confocale verticale con una lente a immersione in acqua 40x. Utilizzare un laser a 405 nm per eccitare la proteina fluorescente ciano (CFP) e acquisire le immagini in entrambi i canali di rilevamento CFP (465-499 nm) e FRET (535-695 nm).
2. Ottimizza i parametri di acquisizione come la velocità di scansione (6), la media (2), l'obiettivo (40x), lo zoom (1x), le dimensioni del foro stenopeico (1 UA) e la risoluzione spaziale (512 x 512). Regolare il guadagno in modo che il segnale si trovi nella gamma dinamica ottimale. Gli stessi parametri devono essere utilizzati per tutti i genotipi.
Immagine dei motoneuroni all'interno del VNC.
1. Posizionare il piatto di silicone con il campione sezionato sotto la lente. Abbassare la lente in modo che entri in contatto con il tampone HL3 trealosio-saccarosio. È fondamentale assicurarsi che l'obiettivo sia completamente immerso nel buffer. Se necessario, aggiungere altro buffer.
2. Utilizzare i canali CFP e FRET per selezionare manualmente una sezione ottica composta da almeno 6 motoneuroni a fuoco, situati lungo la linea mediana VNC. I motoneuroni vengono identificati in base all'espressione del sensore di glucosio e alla posizione lungo l'asse antero-posteriore.
3. Acquisisci immagini ogni 10 s per 10 min. Queste immagini rappresentano la linea di base.
Stimolare con HL-3 integrato con glucosio.
1. Rimuovere il tampone trealosio-saccarosio contenente HL3 utilizzando una pipetta Pasteur e sostituirlo con 5 mM di HL-3 integrato con glucosio (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 10 mM NaHCO₃, 115 mM di saccarosio, 5 mM di glucosio, 5 mM di HEPES, pH 7,1). Questo passaggio deve essere eseguito con grande cura, per evitare il più possibile il movimento del VNC.
2. Acquisisci immagini ogni 10 s per altri 10 min. Queste immagini rappresentano la fase di stimolazione.
Salva le immagini come file .czi o qualsiasi tipo di file supportato dal software di imaging con un nome che includa la data, il background genetico, la condizione sperimentale (linea di base o stimolazione) e i canali utilizzati.
Riutilizzare i parametri per visualizzare tutti i genotipi (Figura 1A).

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Risultati

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Figura 1: Analisi delle immagini del sensore di glucosio nel contesto del mutante TDP-43. (A) Immagini rappresentative dei segnali FRET e CFP nei controlli del sensore di glucosio e nei campioni TDP-43^G298S in condizioni basali e di stimolazione. Un motoneurone rappresentativo è delineato in ogni immagine come esempio di ROI. Barre della scala: 20 μm. Ingrandimento: 40x. (...