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Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Immunocolorazione
NOTA: Eseguire tutti i lavaggi e le incubazioni su un agitatore a piattaforma orbitale impostato a circa 100 giri/min. Tutte le fasi vengono eseguite a temperatura ambiente, ad eccezione dell'incubazione degli anticorpi primari, che viene eseguita a 4 °C. Preparare in anticipo i terreni di montaggio combinando gli ingredienti in una provetta da 50 ml e mescolando su un nutatore per una notte. Proteggere dalla luce e conservare a 4 °C per un massimo di 2 mesi. Se il segnale fluorescente endogeno è sufficiente per l'imaging e l'analisi senza la necessità di immunocolorazione, i passaggi 1.1-1.9 possono essere saltati. Se si salta l'immunocolorazione, eseguire tre lavaggi di 10 minuti in TBS e procedere al passaggio 1.10.
- Preparare una soluzione fresca di TBST (0,2% di Triton in TBS) aggiungendo 1 mL di Triton-X al 10% a una provetta da 50 mL e riempiendo la provetta a 50 mL con 1x TBS. Preparare 2 mL di soluzioni bloccanti e anticorpali (10% di siero di capra in TBST) per ciascun cervello.
NOTA: Per ottenere i migliori risultati, fare un nuovo TBST per ogni nuovo esperimento di colorazione e utilizzare una fonte di alta qualità di Triton-X acquoso al 10% ( Tabella dei materiali).
- Etichettare una piastra a 24 pozzetti secondo lo schema (Figura 1). Posiziona campioni diversi in righe diverse e soluzioni diverse in colonne diverse. Aggiungere 1 mL di TBST alle prime tre colonne ("Lavaggio 1", "Lavaggio 2" e "Lavaggio 3"). Aggiungere 1 mL di soluzione bloccante alla quarta colonna.
- Prepara un plettro di vetro sciogliendo l'estremità di una pipetta Pasteur 5,75 in un piccolo gancio usando un bruciatore Bunsen. Utilizzare questo plettro per trasferire le sezioni di tessuto dalla piastra a 12 pozzetti alla colonna Wash 1 della piastra a 24 pozzetti.
NOTA: Per ottenere i migliori risultati, esaminare le sezioni prima di iniziare la colorazione. Per lo screening delle sezioni, trasferirle una per una in una piastra di Petri riempita con 1x TBS ed esaminare le sezioni utilizzando un microscopio a fluorescenza con un obiettivo 5x o 10x per garantire la presenza di un numero adeguato di cellule marcate in fluorescenza. Si consiglia di colorare da quattro a sei sezioni per pozzetto, anche se se necessario, possono essere colorate fino a otto per pozzetto.
- Lavare le sezioni per 10 minuti ciascuna nei pozzetti Wash 1, 2 e 3, quindi incubarle per 1 ora nella soluzione bloccante. Usa il plettro per trasferire le sezioni da un pozzo all'altro. Il plettro può essere utilizzato per trasferire più sezioni del cervello contemporaneamente.
- Preparare 1 mL di soluzione di anticorpi primari per ciascun campione (ad es. RFP di coniglio 1:2000 o GFP di pollo 1:2000). Aggiungere l'anticorpo alla soluzione anticorpale, agitare brevemente e quindi centrifugare per 5 minuti a ≥ 4.000 x g a 4 °C. Incubare le sezioni nell'anticorpo primario per due o tre notti a 4 °C agitando.
- Dopo l'incubazione degli anticorpi primari, aspirare il TBST del giorno 1 dai pozzetti di lavaggio, aggiungere 1 mL di nuovo TBST a ciascun pozzetto di lavaggio e spostare le sezioni nel primo pozzetto di lavaggio. Lavare le sezioni 3 volte per 10 minuti ciascuna.
NOTA: Per l'aspirazione, utilizzare una pipetta Pasteur da 9 pollici collegata con un tubo a un pallone a vuoto. Come fonte di vuoto è possibile utilizzare linee del vuoto domestiche o una pompa per vuoto elettrica.
- Durante il lavaggio delle sezioni, preparare soluzioni di anticorpi secondari a una concentrazione di 1:200 aggiungendo anticorpi alla soluzione anticorpale (ad esempio, capra anti-coniglio 594 o capra anti-pollo 488). Vorticare brevemente, quindi girare per 5 minuti a ≥ 4.000 x g a 4 °C.
- Incubare le sezioni nell'anticorpo secondario per 3 ore a temperatura ambiente. Proteggere le sezioni dalla luce durante questa fase e tutte le fasi successive per mitigare lo sbiancamento degli anticorpi secondari.
- Dopo l'incubazione secondaria degli anticorpi, aspirare il TBST del giorno 2 dai pozzetti di lavaggio, aggiungere 1 mL di nuovo TBST a ciascun pozzetto di lavaggio e spostare le sezioni nel primo pozzetto di lavaggio. Lavare le sezioni 3 volte in TBST per 10 minuti ciascuna.
- Durante il lavaggio finale, estrarre il supporto di montaggio da 4 °C e lasciarlo riscaldare a temperatura ambiente. Prepara una miscela 2:1 di 1x TBS:acqua distillata e aggiungila a una capsula di Petri. Preparare un vetrino da microscopio aggiungendo 800 μl di 2:1 TBS:dH2O alla superficie.
NOTA: Si consiglia vivamente di utilizzare supporti di montaggio non polimerizzanti. L'indurimento dei mezzi di montaggio può alterare il volume del tessuto, il che può confondere l'analisi del volume del territorio degli astrociti. Una ricetta per un semplice ed economico supporto di montaggio fatto in casa è fornita nella Table of Materials.
- Con un pennello fine, trasferire le sezioni una alla volta dal pozzetto Wash 3 alla piastra di Petri. Questo passaggio rimuove il tritone e aiuta le sezioni ad appiattirsi. Quindi, trasferire le sezioni dalla capsula di Petri nel liquido sul vetrino.
- Usa un pennello per sistemare le sezioni in modo che siano piatte sulla diapositiva. Rimuovere con cautela il liquido in eccesso dal vetrino con una pipetta P1000, quindi procedere con l'aspirazione a vuoto.
NOTA: Aggiungere una punta di pipetta P200 all'estremità della pipetta Pasteur per un controllo più preciso dell'aspirazione del vuoto.
- Una volta rimosso tutto il liquido in eccesso dal vetrino, utilizzare una pipetta di trasferimento per aggiungere immediatamente una goccia di terreno di montaggio a ciascuna sezione e stendere delicatamente un vetrino coprioggetti sul vetrino. Lasciare che il supporto di montaggio si diffonda per alcuni minuti, quindi rimuovere il supporto di montaggio in eccesso che fuoriesce da sotto il vetrino coprioggetti mediante aspirazione a vuoto.
NOTA: Non lasciare asciugare le sezioni prima di aggiungere il supporto di montaggio. Se le sezioni iniziano ad asciugarsi prima dell'aggiunta del terreno di montaggio, ciò può influire sul volume del tessuto e impedire una raccolta accurata dei dati.
- Sigillare tutti e quattro i bordi del vetrino coprioggetti con smalto trasparente. Lasciare asciugare i vetrini per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi conservarli in piano a 4 °C. Attendere almeno 2 ore prima di eseguire l'imaging o l'imaging il giorno successivo.
NOTA: Le sezioni colorate con anticorpi contro GFP (proteina fluorescente verde) e RFP (proteina fluorescente rossa) possono essere conservate fino a 2 settimane prima dell'imaging, a condizione che siano completamente sigillate con smalto per unghie.
