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Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Sezionamento del tessuto
- Tagliare un piccolo pezzo di tessuto (~1 cm x 1 cm) per il sezionamento. Rimettere il fazzoletto rimanente nel congelatore a ghiaccio secco/-80 °C.
NOTA: Assicurarsi che la sezione di tessuto sia ~95% corteccia cerebellare, dove si trovano le cellule di Purkinje.
- Posizionare un cumulo di OCT alto circa 3 mm per coprire il "mandrino". Inizia costruendo gli strati sopra con un movimento lento e circolare fino a quando non c'è un piccolo tumulo.
- Una volta che l'OCT è parzialmente congelato ma ha ancora del liquido al centro, posiziona il fazzoletto sopra di esso. Non spingere il fazzoletto in profondità nell'OCT. Lascia che il fazzoletto si sieda sopra di esso fino a quando non si congela completamente, il che richiederà 1-2 minuti.
- Posizionare il "mandrino" con l'OCT congelato e il fazzoletto nel braccio di taglio del criostato. Regolare il tessuto in modo che sia a filo con la lama di taglio.
- Lasciare riposare il fazzoletto nel braccio di taglio per 15-20 minuti per adattarsi alla nuova temperatura.
NOTA: A seconda dello spessore del tessuto, è necessario del tempo per l'acclimatazione alla temperatura. Lasciare riposare il fazzoletto per il tempo necessario a tagliare in modo netto. Regolare OT e CT per facilitare l'acclimatazione della temperatura dei tessuti.
- Avvicinare lentamente il fazzoletto alla lama. Una volta che il tessuto ha raggiunto la lama, inizia il processo di rifinitura. Lo spessore del taglio deve essere impostato a 30 μm.
- Taglia 2-3 volte fino a quando gli strati della corteccia sono visibili.
- Posizionare e allineare la piastra antirollio appena sopra la lama del criostato.
NOTA: Una linea argentata apparirà dalla luce nel criostato all'interfaccia della lama e della piastra antirollio. Ciò indica che la piastra antirollio si trova direttamente sopra il bordo della lama.
- Iniziare a tagliare le sezioni a 14 μm. Le sezioni tagliate correttamente saranno piatte sotto la piastra antirollio.
NOTA: Se il fazzoletto è bloccato, assicurarsi che la piastra antirollio sia sufficientemente fredda. Se necessario, posizionando un pezzo di ghiaccio secco all'esterno (lato che non tocca il tavolino) si raffredderà rapidamente la piastra antirollio.
- Tagliare 4-6 sezioni e allinearle orizzontalmente lungo il tavolino del criostato.
- Inclinando il vetrino, raccogli tutti i pezzi del tessuto contemporaneamente.
NOTA: Usando le spazzole, sollevare le estremità del fazzoletto per renderle più facilmente disponibili per il vetrino al momento del ritiro. Non raccogliere una sezione alla volta. L'esposizione all'aria a temperatura ambiente degrada l'integrità dell'RNA.
ATTENZIONE: Non lasciare che la membrana tocchi lo stadio del criostato. Se la membrana tocca il tavolino, inizierà a staccarsi dal vetrino e causerà errori durante il tentativo di LCM.
- Passare immediatamente al passaggio 6. Non ritardare la fissazione.
2. Fissaggio di tessuti/visualizzazione senza macchia
- Passa immediatamente al protocollo di fissazione dell'etanolo
- Posizionare il vetrino nel supporto del vetrino con etanolo al 70% per 2 minuti, sul ghiaccio.
- Posizionare il vetrino nel supporto del vetrino con etanolo al 95% per 45 s - sul ghiaccio.
- Posizionare il vetrino nel supporto del vetrino con etanolo al 100% per 2 minuti - a RT.
- Immergere il vetrino 3 volte nel supporto del vetrino con xilene 1 — a RT.
- Posizionare il vetrino nel supporto del vetrino con xilene 2 per 5 minuti — a RT.
- Lasciare asciugare in un luogo pulito per almeno 30 minuti. Tempi di asciugatura più lunghi, fino a 60 minuti, sono ottimali.
ATTENZIONE: Utilizzare guide stand-up per l'asciugatura in una cappa aspirante. Lo xilene è volatile. La posa dei vetrini in piano causerà il ristagno dello xilene nella sezione del tessuto, rendendo il tessuto troppo scuro.
3. Scongelamento dei vetrini memorizzati per l'uso
- Rimuovere il tubo con un solo cursore dal congelatore a -80 °C 1 ora prima dell'uso previsto.
- Non aprire immediatamente il tubo. Lasciare che il tubo raggiunga la temperatura ambiente. La condensa si verificherà solo all'esterno del tubo.
- Una volta che il tubo ha raggiunto la temperatura ambiente e tutta la condensa è sparita (circa 30-40 minuti), rimuovere il tappo ed esporre il vetrino all'aria a temperatura ambiente.
- Lasciare che il vetrino si acclimati a temperatura ambiente per 15-20 minuti. Quindi, lasciarlo all'interno del tubo con il tappo rimosso.
NOTA: La diapositiva è ora pronta per LCM.
4. Microdissezione a cattura laser delle cellule di Purkinje:
NOTA: Questa sezione del protocollo discuterà solo le specifiche relative alla cattura delle cellule di Purkinje per il successivo sequenziamento dell'RNA. Questa sezione presuppone che l'utente abbia familiarità con il microscopio a cattura laser UV e il software affiliato.
- Pulire il tavolino del microscopio e il braccio di raccolta dei tappi con il decontaminatore a RNasi.
- Con le mani guantate, posizionare il vetrino sul microscopio e il cappuccio opaco da 500 μl nel braccio di raccolta.
NOTA: Assicurarsi sempre che la corretta tecnica RNA pulisca l'area di lavoro con un decontaminatore RNasi e utilizzando le mani guantate mentre si tocca il vetrino o il cappuccio opaco. I guanti possono essere rimossi una volta che il vetrino e il cappuccio sono in posizione e l'acquisizione laser è iniziata.
- A basso ingrandimento, allineare il cappuccio opaco sul tessuto cerebellare, assicurandosi che il cappuccio copra l'intera area visualizzata nell'oculare.
NOTA: Solo l'oculare del microscopio mostrerà se la calotta opaca è centrata. La fotocamera non mostrerà se il cappuccio è centrato sul tessuto. A seconda del design dell'oscilloscopio di acquisizione laser, la visualizzazione attraverso il cappuccio opaco sarà solo nell'oculare o visualizzata sia nell'oculare che nella fotocamera.
- Visualizzare gli strati cerebellari con una lente obiettiva 5x - 10x e posizionare il cursore sulla sezione in cui lo strato molecolare e lo strato di cellule granulari si intersecano (lo strato di cellule di Purkinje).
- Passa a 40X e visualizza le celle di Purkinje.
NOTA: Vedere Figura 1 e Figura 2 per esempi di visualizzazioni.
- Inizia a catturare le cellule di Purkinje.
NOTA: Sono necessari almeno 5 ng di RNA per eseguire il sequenziamento dell'RNA. Circa 1600-2000 cellule di Purkinje producono abbastanza materiale RNA per il sequenziamento. L'RNA sarà stabile per un massimo di 8 ore al microscopio. Testare l'energia UV e la concentrazione UV prima della raccolta per assicurarsi che i livelli siano corretti. Nel tempo, il tessuto continuerà ad asciugarsi e potrebbe essere necessario modificare l'energia UV e la messa a fuoco UV.
