$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Conservare i cervelli
- Rimuovere rapidamente il cervello da topi adulti CD1 wildtype soppressi del peso di circa 30 g utilizzando un approccio convenzionale e congelare per 60 secondi in azoto liquido o isopentano pre-raffreddato con ghiaccio secco.
- Conservare i cervelli congelati a -80 °C in un foglio di alluminio o in tubi conici fino al momento dell'uso.
2. Preparazione della matrice cerebrale
- Ventiquattro ore prima di sezionare il tessuto, posizionare una matrice cerebrale pulita su una pila di confezioni congelate scongelate. Inserire i lati della matrice tra due confezioni per congelatore assicurandosi di lasciare circa 0,5 cm tra la parte inferiore delle fessure del rasoio e la parte superiore delle confezioni di gel (Figura 1A). Posizionare un foglio di alluminio sulle estremità per facilitare il raffreddamento.
NOTA: Quando acquisti una matrice cerebrale, acquistane una abbastanza grande da racchiudere l'intero volume del cervello da sezionare.
- Mettere la scatola contenente la matrice cerebrale e le confezioni del congelatore in un congelatore a -20 °C con la parte superiore socchiusa per una notte.
3. Impostazione di una lastra di vetro congelata
NOTA: Lo scopo di questa configurazione è preparare una superficie ghiacciata su cui sezionare le sezioni del cervello.
- Mettere il ghiaccio in una scatola isolata fino a circa 5 cm dall'alto. Quindi posizionare uno strato di ghiaccio secco di 2,5 cm sopra il ghiaccio e coprire con un telo di plastica nera per facilitare la visualizzazione del campione (Figura 1B, Figura 1C).
- Posiziona una lastra di vetro (dovrebbe entrare solo nell'apertura della scatola) sopra la plastica e posiziona del ghiaccio secco sopra la piastra negli angoli più lontani (Figura 1C).
- Prendi la matrice cerebrale congelata dal congelatore e inserisci il cervello da tagliare con la corteccia rivolta verso l'alto. Lasciarlo equilibrare alla temperatura nella scatola per 10 minuti. Tieni il coperchio sulla scatola durante questo periodo.
- Regolare la posizione del cervello nella matrice con una pinza fredda in modo che il seno sagittale e il seno trasverso siano allineati con le scanalature perpendicolari del blocco (Figura 1D). Ciò contribuirà a garantire sezioni simmetriche per una più facile dissezione. Toccare brevemente le punte delle pinze per asciugare il ghiaccio per raffreddarlo prima di regolare il cervello.
- Una volta che il cervello è in posizione, posizionare una lama di rasoio raffreddata vicino al suo centro e premere la lama per circa 1 mm nel tessuto. Aggiungi lame fredde alle estremità rostrale e caudale per aiutare a mantenere il cervello in posizione (Figura 2A e Figura 2B).
- Partendo dall'estremità rostrale, aggiungere le lame una alla volta, inserendole nelle fessure e premendole delicatamente nel tessuto per circa 1 mm (Figura 2B). Continuare ad aggiungere lame a intervalli di 1 mm lavorando verso l'estremità caudale.
- Assicurati che il cervello non si sposti durante questo periodo. Allineare le lame orizzontalmente e verticalmente (Figura 2B). Le lame per microtomo a basso profilo possono essere utilizzate per tagliare sezioni in larghezze di 0,5 mm. Posizionali tra le lame di rasoio più grandi (Figura 2C).
- Una volta posizionate le lame, premere sulla parte superiore del gruppo con le dita, il palmo o un'altra superficie piana (Figura 2C, Figura 2D). Scuotere lentamente il gruppo di lame da un lato all'altro per spostarle attraverso il tessuto.
nota: Questa operazione può richiedere un po' di tempo (1-2 minuti) e pazienza. Dovrebbe esserci resistenza alle lame che si muovono attraverso il tessuto. L'ingresso facile significa che il cervello si sta scongelando e il blocco deve essere raffreddato con ghiaccio secco.
- Quando tutte le lame hanno raggiunto il fondo delle fessure, afferrare ciascun lato del gruppo di lame e oscillare avanti e indietro per liberarsi dalla matrice.
nota: Prestare attenzione per evitare di tagliarsi sui bordi taglienti delle lame.
- Una volta che il gruppo è libero, posizionare la pila, con il lato rostrale rivolto verso l'alto, sulla lastra di vetro (Figura 2E). Posizionare il ghiaccio secco accanto e/o sopra la pila per congelare ulteriormente i campioni e facilitarne la separazione.
- Posiziona la pila con gli spigoli vivi rivolti verso il basso sulla lastra di vetro e separa le lame spostando la pila tra i pollici e le dita. Le lame devono separarsi l'una dall'altra con sezioni attaccate.
- Allineare le sezioni sulla lastra di vetro dal rostrale alla caudale (Figura 2F).
- Separare il tessuto dalle lame flettendo le lame tra le dita o separandole con un secondo rasoio freddo (Figure 2G, 2H, 2I).
4. Sezionare le sezioni
- Apri l'Allen Mouse Brain Atlas o un altro riferimento e trova i punti di riferimento necessari per identificare le regioni di interesse. Alcuni punti di riferimento evidenti includono la commessura anteriore, il corpo calloso, i ventricoli laterali e l'ippocampo (Figura 3).
- Capovolgere la sezione da tagliare con una pinza refrigerata e assicurarsi che la regione che sta per essere raccolta sia coerente in tutto. Durante la raccolta, consultare spesso l'atlante di riferimento per assicurarsi di ottenere il ROI corretto.
NOTA: Una lente d'ingrandimento o un microscopio da dissezione sono spesso utili in questo processo. Anche una buona illuminazione è essenziale. A questo scopo è possibile utilizzare lampade a LED a bassa potenza o una lampada fredda.
- Con un bisturi o un punzone pulito, tagliare la sezione (Figura 4). Preraffreddare ogni utensile prima di tagliarlo toccandolo brevemente per asciugare il ghiaccio. Spingere la lama delicatamente ma con decisione nel tessuto, facendola oscillare avanti e indietro per eseguire il taglio. Non spingere troppo forte o il tessuto si fratturerà.
NOTA: Gli strumenti si riscalderanno nel tempo. Le lame leggermente riscaldate possono aiutare a fare tagli netti e limitare la frattura, ma fai attenzione a evitare di scongelare i tessuti. Raffreddare periodicamente gli strumenti su ghiaccio secco.
- Una volta raccolto un ROI, inserirlo in provette da 1,5 ml etichettate e prerefrigerate. Conservare i tessuti raccolti a -80 °C fino al momento del bisogno.
