Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Coltura e carico del disco intervertebrale (IVD)
- Trasferire i dischi intervertebrali (IVD) nelle camere IVD e aggiungere il terreno di coltura IVD (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, 4,5 g/L di DMEM ad alto contenuto di glucosio per il gruppo fisiologico e 2 g/L di DMEM a basso contenuto di glucosio per il gruppo patologico) + 1% di penicillina/streptomicina + 2% di siero fetale di vitello + 1% di ITS (contiene 5 μg/mL di insulina, 6 μg/mL di transferrina e 5 ng/mL di acido selenioso) + 50 μg/mL di ascorbato-2-fosfato + 1% di amminoacido non essenziale + 50 μg/mL di agente antimicrobico per le cellule primarie) e posto in un incubatore a 37 °C, 85% di umidità e 5% di CO2.
- Coltura dei dischi per 4 giorni all'interno di un sistema di bioreattori secondo gruppi sperimentali. Nel gruppo patologico, mantenere le condizioni di carico degenerativo a 0,32-0,5 MPa, 5 Hz per 2 ore/giorno. Nel gruppo di controllo fisiologico, utilizzare un protocollo di carico di 0,02-0,2 MPa, 0,2 Hz per 2 ore/giorno.
NOTA: Posizionare gli IVD in camere contenenti 5 ml di terreno IVD durante le procedure di caricamento. Il volume dipende dalle dimensioni delle camere di carico del bioreattore. Tra le procedure di caricamento, posizionare gli IVD in piastre a sei pozzetti con 7 mL di terreno di coltura IVD per il recupero del rigonfiamento libero.
- Per analizzare le variazioni dell'altezza del disco durante il periodo sperimentale, misurare l'altezza del disco con un calibro dopo la dissezione IVD (basale) e poi quotidianamente dopo il periodo di rigonfiamento libero e dopo il carico dinamico per la durata dell'esperimento.
2. Iniezione intradiscale del fattore di necrosi tumorale-alfa (TNF-α)
- Subito dopo il primo ciclo di carico dinamico del giorno 1, posizionare gli IVD in una piastra di Petri in posizione verticale e stabilizzare gli IVD con una pinzetta.
- Iniettare TNF-α ricombinante (100 ng in 70 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per IVD) con un ago da insulina calibro 30 nel tessuto del nucleo polposo del gruppo patologico. Iniettare lentamente a una velocità di circa 70 μl in 1 minuto.
- Dopo l'iniezione, tirare la siringa a metà all'interno dell'IVD e tirare lo stantuffo della siringa per creare un vuoto che impedisca la fuoriuscita della soluzione iniettata prima di rimuovere completamente l'ago e la siringa dall'IVD.
NOTA: Eseguire un esperimento pilota iniettando PBS contenente colorante blu di tripano per valutare la distribuzione della soluzione iniettata dopo il carico e la coltura notturna.
