Induzione di lesioni cerebrali traumatiche in un modello di ratto utilizzando un dispositivo a percussione fluida laterale

Abstract

Fonte: McGuire, M. J., et al. Uso di un sistema video-EEG wireless per monitorare le scariche epilettiformi a seguito di lesione cerebrale traumatica indotta da percussione laterale di fluidi. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video dimostra l'induzione di una lesione cerebrale traumatica (TBI) in un ratto utilizzando un dispositivo per lesioni a percussione fluida laterale (FPI). La procedura prevede la creazione di un foro nel cranio di un ratto anestetizzato per esporre la dura madre, su cui è attaccata una cannula. Il ratto viene quindi collegato al dispositivo, che genera un'onda di pressione che raggiunge il cervello, imitando il trauma cranico causando la morte delle cellule neurali e il danno vascolare

Protocollo

1. Lesione da percussione fluida

1. Indossare un camice da laboratorio o un camice chirurgico, una maschera chirurgica, guanti chirurgici e copricapo e sterilizzare tutti gli strumenti e i materiali che entrano in contatto con il sito chirurgico.
2. Anestetizzare un ratto Wistar maschio di 10-12 settimane (350-400 g) con isoflurano al 3% e 1 L/min di ossigeno in una camera di induzione di dimensioni adeguate per i ratti. Rimuovi il ratto dalla camera di induzione e spostalo nell'area di preparazione una volta che è incosciente. Metti l'unguento oftalmico sterile in entrambi gli occhi.
3. Rasare i peli sulla testa del topo con un tagliacapelli elettrico con una lama #40 da appena sopra gli occhi alla base caudale delle orecchie per produrre un campo chirurgico sufficiente. Rimuovi tutti i peli sciolti e tagliati dal sito.
4. Pulire il sito chirurgico applicando uno scrub con cloroesidina al 2% sul cuoio capelluto rasato seguito da etanolo al 70%. Inizia dal centro e spostati verso l'esterno in cerchi concentrici lontano dal sito di incisione. Ripeti questo processo 3 volte. Applicare la soluzione di Betadine sul sito allo stesso modo e lasciare asciugare.
5. Posizionare il ratto anestetizzato nel telaio stereotassico e mantenere l'anestesia al 2-3% di isoflurano-1 L/min di ossigeno attraverso il cono nasale. Verificare la perdita del riflesso di ritiro dell'arto posteriore e la perdita del riflesso palpebrale per assicurarsi che il ratto si trovi in un piano chirurgico di anestesia.
6. Monitorare la frequenza respiratoria, la frequenza cardiaca, la temperatura corporea e la saturazione di ossigeno durante l'intervento. Mantenere la frequenza cardiaca tra 300-400 bpm e SpO₂ superiore al 90%.
   nota: Un pulsossimetro collegato a un piede posteriore può essere utilizzato per fornire la lettura costante della frequenza cardiaca e della SpO₂. Una frequenza cardiaca superiore a 400 bpm indica che il ratto non è sufficientemente anestetizzato. Un cuscinetto riscaldante autoregolante, accoppiato a un termometro rettale, impostato a 37 °C, può essere posizionato sotto il ratto durante l'intervento chirurgico per mantenere la temperatura corporea. Uno stereomicroscopio con una sorgente luminosa in combinazione con una lampada a fibre ottiche è utile per visualizzare la procedura.
7. Utilizzare un ago da 23 g per iniettare lo 0,5% di bupivacaina cloridrato per via intradermica nel cuoio capelluto nel sito di incisione per l'analgesia locale 10 - 15 minuti prima di eseguire un'incisione.
8. Praticare un'incisione della linea mediana di 1,5-2,5 cm attraverso la pelle e il muscolo del cuoio capelluto utilizzando una lama di bisturi #10. Ritrarre la pelle e il muscolo per esporre il cranio e fornire un campo chirurgico chiaro. Riflettere la fascia sottostante e il tessuto adiposo lontano dall'osso con tamponi di cotone sterili.
   nota: Un'unità cauterica elettrica è utile per ottenere un'emostasi rapida.
9. Radere la cresta laterale dell'osso parietale sinistro utilizzando una curette chirurgica per produrre una superficie liscia e piana in modo che la base del mozzo Luer lock femmina-femmina possa poggiare a filo con il cranio.
10. Irrigare la superficie del cranio e i tessuti circostanti con 2,0 mg/mL di soluzione di gentamicina in soluzione fisiologica sterile. Tamponare la soluzione in eccesso con un tampone sterile.
11. Applicare il 3% di perossido di idrogeno sul cranio per asciugare l'osso.
    nota: Se l'osso non è sufficientemente asciutto, il cemento dentale non aderirà correttamente e formerà una solida tenuta.
12. Creare un sito di craniectomia di 5 mm di diametro attraverso l'osso parietale sinistro.
    nota: Una punta di trephine inserita in un trapano elettrico attaccato al telaio stereotassico può essere utile per avviare la craniectomia. Utilizzare un trapano a mano con un trapano a mano di 5 mm di diametro per terminare lentamente la craniectomia attraverso l'osso rimanente. Quando si è vicini al completamento della craniectomia, ruotare la trefina al contrario per evitare la rottura della dura madre sottostante. Ci sarà un assottigliamento del cranio attorno al perimetro del disco e il lembo del cranio si sentirà allentato se premuto leggermente.
13. Rimuovere il lembo osseo con la curette chirurgica e la pinza per tessuti lisci.
    nota: Può verificarsi un po' di sanguinamento, ma l'emostasi può essere raggiunta rapidamente applicando una leggera pressione con tamponi di cotone sterili.
14. Utilizzare uno stereomicroscopio e l'illuminazione per ispezionare visivamente la dura madre alla ricerca di eventuali segni di rottura. Un sottile bordo osseo rimarrà attorno alla circonferenza del sito della craniectomia. Rimuovere delicatamente questo bordo con una pinza per tessuti lisci, facendo attenzione a non rompere la dura.
15. Tamponare il cranio con etanolo al 70% per rimuovere la polvere ossea e asciugare il cranio.
16. Applicare uno strato sottile di colla gel cianoacrilato attorno al bordo inferiore del mozzo Luer lock e fissarlo al cranio sopra la craniectomia senza ostruire l'apertura. Prestare attenzione a non portare la colla a contatto con la dura. Inoltre, sigillare il Luer lock in posizione con un ulteriore strato sottile di colla attorno alla base esterna del mozzo.
17. Preparare un impasto di cemento dentale. Applicare il cemento sulla superficie del cranio intorno e sopra la base del mozzo Luer lock per fissarlo in posizione.
18. Riempire il mozzo Luer lock con una soluzione sterile di liquido cerebrospinale artificiale (CSF) (pH 7,4) utilizzando una siringa e un ago in modo che un bolo convesso di soluzione fisiologica possa essere visto sopra la parte superiore del bordo.
    nota: La soluzione manterrà la dura dura umida mentre il cemento dentale si asciuga e funge da indicazione dell'integrità del sigillo. Se il livello della soluzione scende, ciò indica una perdita nel sistema e il blocco Luer deve essere rimosso e sostituito.
19. Una volta che il cemento dentale è completamente indurito, interrompere l'anestesia gassosa e rimuovere il ratto dal telaio stereotassico.
20. Posiziona il ratto su una piattaforma accanto al dispositivo FPI.
21. Il dispositivo FPI ha una punta metallica curva che si estende dal trasduttore di pressione all'estremità del serbatoio del fluido. Fissare un tubo di pressione lungo 12 cm all'estremità della punta curva con l'estremità opposta che termina con un connettore Luer lock maschio a torsione da 2 cm. Fissare il ratto al dispositivo FPI collegando l'estremità femmina del mozzo sul cranio del ratto al connettore maschio.
    nota: Assicurarsi che la connessione sia ben fissata e che tutte le bolle d'aria siano state rimosse dal sistema.
22. Posizionare l'animale in decubito sternale e controllare ripetutamente il ritorno del riflesso di ritiro. Non appena il ratto riacquista il riflesso di ritiro ma è ancora sedato, rilasciare il pendolo del dispositivo FPI per provocare un singolo impulso di pressione di 20 ms e indurre lesioni.
    nota: È importante non indurre la lesione mentre l'animale è profondamente anestetizzato poiché ciò tende a causare un aumento della mortalità a causa dell'edema polmonare indotto da neurogeni. Tutti i dispositivi mostrano variabilità. Tuttavia, sul dispositivo utilizzato per questo esperimento, un angolo di posizionamento del martello di 17° produce un impulso di pressione atmosferica di 2,2 - 2,3. Gli animali finti illesi vengono sottoposti a tutte le stesse procedure, ad eccezione dell'impulso fluido effettivo per indurre lesioni.
23. Scollegare immediatamente il ratto dal dispositivo FPI dopo la lesione, metterlo in decubito sternale e fornire ossigeno supplementare (1 L/min) attraverso un cono nasale fino al ritorno della respirazione spontanea. L'apnea è una conseguenza prevista dell'infortunio. Se necessario, fornire respiri manuali periodici tramite una maschera con valvola a sacco fino a quando il ratto inizia a respirare spontaneamente da solo.
    nota: In genere, l'apnea dura meno di 2 minuti. Un rapido aumento transitorio della frequenza cardiaca (>500 bpm) si osserva immediatamente dopo la somministrazione dell'impulso di pressione a causa dello scoppio di una catecolamine. Questo può essere monitorato con un pulsossimetro attaccato al piede del ratto e può servire come possibile indicatore che si è verificata una grave lesione.
24. Monitorare continuamente il ratto e registrare il tempo di ritorno del riflesso raddrizzante (deambulazione stabile su tutti e quattro gli arti).
25. L'entità dell'impulso di pressione atmosferica per ciascun ratto dovrebbe essere compresa tra ± 0,05 atmosfere l'uno dall'altro. Verificare che ciascuno degli impulsi di pressione produca un segnale uniforme sull'oscilloscopio con ampiezza e durata costanti.
    nota: Un segnale rumoroso può indicare bolle d'aria nel sistema che devono essere rimosse prima di erogare l'impulso della lesione. Gli impulsi di pressione atmosferica che producono una grave lesione, in questo esperimento, sono quelli che tipicamente determinano tempi di raddrizzamento degli animali di 30-60 minuti. Questo intervallo di tempi di raddrizzamento è associato a un tasso di mortalità di circa il 40-50%).
26. Somministrare 10 ml di soluzione fisiologica preriscaldata per via sottocutanea come terapia di supporto.
27. Rimetti il ratto nella sua gabbia di casa e lascialo riprendersi per almeno 4 h.
    nota: È stato osservato un aumento della mortalità quando i ratti vengono rimessi immediatamente sotto anestesia.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Punte da trapano da 1,00 mm	Drill Bit City: Nuovi strumenti in metallo duro	05M200
3M ESPE Durelon Cemento carbossilato	3M , Neuss Germania	Telefono 38019	Cemento dentale
Sutura 4-0	Ethicon, Sommerville, NJ	K831H	4-0 Ethicon Perma-hand Silk, 26mm 1/2c Taperpoint, 30" (75cm), sutura intrecciata nera non assorbibile
Diametro esterno 5 mm trephine	Strumenti per la scienza	Codice: 18004-50
Pinze Dumont #6	Strumenti per la scienza	Codice: 11260-20
Dumont #7b Pinze	Strumenti per la scienza	Codice: 11270-20
ecgAUTO	EMKA Technologies, Falls Church, VA
Accoppiatore femmina con filettatura Luer in policarbonato trasparente	Strumento Cole-Palmer	SKO#45501-22	Ordina il lotto #214271
Trapano elettrico a pedale	Grobet Stati Uniti d'America, Carlstadt, NJ	Modello C-300
GentaMax 100 (gentamicina, soluzione di solfato)	Phoenix, prodotto da Clipper Distributing Company LLC, St. Giuseppe, MO		NDC 57319-520-05
Hill's Prescription Diet a/d canino/felino	Hill's Pet Nutrition, Inc., Topeka, KS
Software IOX2	EMKA Technologies, Falls Church, VA
Isoflorano, USP	Piramal Enterprise Limited, Andhra, India		NDC 66794-013-25
Macchina per anestesia IsoTech	SurgiVet	WWV9000
Dispositivo FPI laterale	AmScien	302	punta curva, con prolunga del tubo di pressione. collegato tramite connettore di blocco a vite (Cole-Palmer; #4550-22)
Stereomicroscopio Leica A60	Leica Biosystems, Richmond, VA	Codice: 10 450 488
Marcaina (0,5%) Bupivacaina hcl iniezione usp 5 mg/mL	Hospira, Lake Forest, IL	CA-3627	Flaconcino multidose da 50 ml; NDC 0409-1610-50
Pinze Micro-Adson	Strumenti per la scienza	Codice: 11018-12
Portaaghi Olsen-Hegar con taglierine	Strumenti per la scienza	Codice: 12002-14
Cemento osseo PALACOS R+G con gentamicina	Heraeus,	RIFERIMENTO ANNUNCIO: 5036964	Cemento osseo radiopaco contenente 1 x 0,5 g di gentamicina
Soluzione di iodio povidone			Betadina
Puralube Unguento Veterinario	Prodotti veterinari Dechra, Overland Park KS		NDC 17033-211-38
Lama per bisturi (#10) e supporto	Integra Miltex, York, PA	RIFERIMENTO: 4-110
Manico per bisturi - #4	Strumenti per la scienza	Codice 10004-13
Coltello a falce	Strumenti Bausch + Lomb Storz	N1705 HM	Lama curva da 5 mm. Manico rotondo. Lunghezza totale 168 mm, 6,6 pollici.
Silverstein Micro Specchio	Strumenti Bausch + Lomb Storz	N1706 S8	Diametro 3 mm. Angolato di 45 gradi. Lunghezza totale 180 mm, 7,2 pollici
Unità di Cauterizzazione Termica	Geiger Medical Technology, Delasco Council Bluffs, IA	Modello n.: 150
Vetivex	Prodotti veterinari Dechra, Overland Park KS		per iniezione veterinaria pHyLyteTM pH 7.4 (Iniezione di elettroliti multipli, Tipo 1, USP)
Ratti Wistar IGS	Fiume Carlo	Codice ceppo 003	12 settimane al momento dell'infortunio
Divaricatore di Wullstein	Strumenti per la scienza	Codice: 17018-11