Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dalla revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione prima della raccolta dei tessuti
- Impostare la centrifuga a 4 oC.
- Lucidare a fuoco un set di tre pipette Pasteur in vetro con diametri decrescenti di circa 1,3, 0,8 e 0,4 mm per ogni campione.
- Preparare provette da 1,7 ml contenenti 1 ml di tampone A freddo e mantenere le provette in ghiaccio.
- Preparare una vaschetta per il ghiaccio contenente la matrice per affettare il cervello, le spatole e le piastre di vetro (o la piastra di Petri in vetro rovesciato) su cui eseguire la dissezione. Pre-raffreddare due o più lamette sulle lastre di vetro e utilizzare fazzoletti di carta per asciugare tutti gli strumenti che toccano il fazzoletto.
- Scongelare la soluzione enzimatica a temperatura ambiente (RT) per 30 minuti prima della raccolta dei tessuti.
2. Raccolta e dissezione dei tessuti
- Iniziare il trattamento comportamentale o farmacologico 90 minuti prima del prelievo tissutale.
nota: Per i risultati qui mostrati, sono state eseguite iniezioni acute intraperitoneali di 5 mg/kg di metanfetamina su ratti in un nuovo ambiente (condizione di test) e ratti naïve tenuti nelle loro gabbie domestiche (condizione di controllo).
- Anestetizzare il ratto mettendolo in un barattolo essiccante di vetro con isoflurano saturo e decapitare il ratto 30 - 60 secondi dopo usando una ghigliottina><.
Usa le forbici per rimuovere la pelle e i muscoli dalla testa ed esporre il cranio. Usa i rongeur per tagliare il cranio, aprire il forame magno e rimuovere la parte posteriore del cranio. Usa i rongeur per tagliare lungo i bordi superiori del cranio per esporre il cervello. Fai attenzione a non danneggiare il cervello. Usa una piccola spatola per raccogliere delicatamente sotto ed elevare il cervello. Solleva il cervello e taglia i nervi fino a quando il cervello non è libero.
- Sezionare il tessuto usando lame di rasoio.
nota: Ottenere campioni di tessuto utilizzando uno dei seguenti metodi: (2.3.1) tessuto appena sezionato; (2.3.2) tessuto congelato dopo la dissezione; o (2.3.3) tessuto congelato sezionato da cervello intero congelato. Mantenere asciutti la matrice di taglio del cervello, le lame di rasoio e la lastra di vetro durante i processi di dissezione e tritatura, poiché l'acqua condensata può portare alla lisi ipotonica delle cellule. Utilizzare lenti d'ingrandimento per garantire una dissezione accurata.
- Per il tessuto appena sezionato, posizionare il cervello appena estratto in una matrice di taglio del cervello (uno stampo metallico a forma di cervello di ratto con fessure per le lame del rasoio a intervalli di 1 mm) che è stato raffreddato sul ghiaccio. Inserire due o più lame di rasoio pre-raffreddate nelle fessure per tagliare le fette coronali che contengono le regioni cerebrali di interesse. Posizionare la fetta tagliata sulla lastra di vetro raffreddata.
Nota: sezionare le regioni cerebrali di interesse su una lastra di vetro freddo.
- Per il tessuto congelato dopo la dissezione, sezionare la regione o le regioni cerebrali di interesse da fette di cervello appena estratto, in modo simile a quello descritto sopra al punto 2.3.1. Posizionare il tessuto sezionato in una microprovetta e congelare rapidamente il tessuto immergendo la microprovetta in isopentano a -40 ºC per 20 secondi. Conservare il tessuto sezionato sempre congelato in un congelatore a -80 ºC fino a ulteriore lavorazione.
- Per i tessuti congelati, congelare immediatamente il cervello appena estratto in isopentano a -40 ºC e conservare in un sacchetto sigillato a -80 ºC per un massimo di 6 mesi.
- Il giorno della dissezione, posizionare il cervello congelato in un criostato impostato a circa -20 ºC (non più caldo di -18 ºC) per circa 2 ore per bilanciare la temperatura.
nota: I cervelli possono essere tagliati facilmente a questa temperatura, mentre temperature molto più fredde rendono il cervello troppo fragile per essere tagliato in sicurezza.
- Usa le lame di rasoio per tagliare fette coronali di 1 - 2 mm di cervelli congelati in un criostato. In condizioni di congelamento, utilizzare un ago smussato da 12 a 16 gauge per ottenere punzoni di tessuto da queste fette. Mantenere il tessuto sezionato sempre congelato fino a un'ulteriore elaborazione.
- Aggiungere 1 - 2 gocce di tampone A per coprire il tessuto sezionato prima di tritare. Rimuovere la maggior parte della sostanza bianca dal tessuto utilizzando due lame di rasoio per prevenire la perdita di neuroni durante il resto del processo di triturazione. Se si inizia con un fazzoletto congelato, lasciare scongelare il fazzoletto sulla lastra di vetro fredda per non più di 1 minuto prima di applicare la soluzione di tampone A.
- Tritare il tessuto 100 volte in ciascuna direzione ortogonale con una lama di rasoio su una lastra di vetro raffreddata. Tenere la lama del rasoio verticalmente sulla lastra di vetro durante la tritatura.
nota: Un mincing accurato è fondamentale per tutti i passaggi del protocollo.
- Utilizzare lame di rasoio per trasferire il tessuto tritato in provette da microcentrifuga contenenti 1 ml di tampone freddo A. Capovolgere la provetta 3 - 5 volte per mantenere tutto il tessuto tritato nella soluzione.
3. Dissociazione cellulare
NOTA: Usa una miscelazione delicata da un capo all'altro per tutti i passaggi seguenti. Non utilizzare un miscelatore a vortice ed evitare bolle d'aria che causano danni alle celle.
- Centrifugare le provette del campione a 110 x g per 2 minuti a 4 ºC. Scartare il surnatante. Aggiungere lentamente 1 ml di soluzione enzimatica fredda e appena scongelata (contenente una miscela di enzimi proteolitici) lungo la parete interna della microprovetta. Aspirare immediatamente l'intero pellet e pipettare delicatamente su e giù solo 4 volte con una pipetta di diametro della punta moderatamente grande per disperdere il pellet di tessuto tritato.
- Capovolgere immediatamente le microprovette per evitare che il pellet si attacchi al fondo e incubare i campioni con miscelazione end-over-end per 30 minuti a 4 oC.
- Dopo la digestione enzimatica del tessuto, centrifugare le provette a 960 x g per 2 minuti a 4 ºC. Rimuovere il surnatante e aggiungere 0,6 ml di tampone A freddo. Immediatamente dopo l'aggiunta del tampone A, utilizzare lo stesso puntale della pipetta per disperdere il pellet aspirando l'intero pellet e pipettare delicatamente su e giù per 5 volte.
- Triturare meccanicamente il tessuto digerito e raccoglierlo in provette da 15 ml seguendo i passaggi seguenti. Per ogni campione, utilizzare un set separato di 3 pipette Pasteur in vetro lucidato a fuoco con diametri discendenti di circa 1,3, 0,8 e 0,4 mm fissate a bulbi di lattice.
- Triturare delicatamente ogni campione 10 volte con la pipetta di vetro da 1,3 mm. Lasciare riposare il campione per 2 minuti sul ghiaccio (i detriti e le cellule non dissociate si depositeranno sul fondo). Raccogliere il surnatante (~ 0,6 ml) e trasferirlo in una provetta conica da 15 ml (provetta #1).
- Aggiungere 0,6 ml di soluzione di Buffer A al pellet rimanente. Triturare il campione 10 volte con la pipetta di vetro da 0,8 mm. Lasciare riposare il campione per 2 minuti sul ghiaccio. Raccogliere il surnatante (~ 0,6 ml) e trasferirlo nello stesso tubo conico da 15 ml #1.
- Aggiungere 0,6 ml di soluzione di Buffer A al pellet rimanente. Triturare il campione 10 volte con la pipetta di vetro da 0,4 mm. Lasciare riposare il campione per 2 minuti sul ghiaccio. Raccogliere il surnatante (~ 0,6 ml; senza toccare il pellet con le cellule non dissociate) e trasferirlo nella stessa provetta conica da 15 ml #1.
nota: Conservare la pipetta da 0,4 mm di diametro nella provetta #1 per le successive fasi di triturazione.
- Ripetere il passaggio 3.4.3 altre tre volte utilizzando la pipetta di vetro più piccola (~ 0,4 mm di diametro) e raccogliere il surnatante in una provetta conica separata da 15 ml (provetta #2).
- Triturare le sospensioni cellulari raccolte nelle provette #1 e #2 per altre 10 volte utilizzando la pipetta di vetro da 0,4 mm e tenerle in ghiaccio.
4. Fissazione e permeabilizzazione cellulare
- Preparare 4 microprovette per campione (due microprovette per le cellule della provetta #1 e due per le cellule della provetta #2) aggiungendo 800 μl di etanolo freddo al 100% (conservato a -20 oC prima dell'uso) in ciascuna provetta e tenerle in ghiaccio. Nota: la concentrazione finale di etanolo sarà del 50%.
- Pipettare ~ 800 μl delle sospensioni cellulari (dalla provetta #1 e dalla provetta #2) in ciascuna delle 4 provette contenenti etanolo freddo e capovolgere le provette per miscelare i campioni.
- Incubare le provette con ghiaccio per 15 minuti capovolgendo le provette ogni 5 minuti.
- Dopo la fissazione/permeabilizzazione, centrifugare le provette a 1.700 x g per 4 minuti a 4 ºC ed eliminare il surnatante. Lasciare 50 μl di soluzione per prevenire la perdita cellulare.
nota: I pellet in questa fase sono bianchi e si attaccano meno alla parete dei tubi rispetto a prima della permeabilizzazione. Pertanto, rimuovere con cautela il surnatante toccando la parete della microprovetta dove non c'è pellet e aspirare lentamente il surnatante utilizzando una micropipetta.
5. Filtrazione cellulare
- Risospendere i pellet del passaggio 4.4 con PBS freddo come segue:
- Aggiungere 550 μl di PBS freddo a una delle due microprovette provenienti dalla provetta #1 e utilizzare un puntale per pipetta di diametro moderato per pipettare delicatamente la sospensione cellulare su e giù per 5 volte. Ripetere lo stesso per un microtubo proveniente dal tubo #2.
- Per le cellule della provetta #1, utilizzando la stessa pipetta, trasferire la prima sospensione cellulare nel secondo pellet. Risospendere il secondo pellet pipettando delicatamente la sospensione cellulare combinata su e giù per 5 volte.
- Per le celle della provetta #2, risospendere e combinare i pellet (cioè la terza e la quarta microprovetta) come descritto al punto 5.1.2.
