Aumentare le rese cDNA da singola cellula quantità di mRNA nelle reazioni standard di laboratorio della trascrittasi inversa utilizzando Microstreaming acustico

Sommario

Descriviamo un nuovo metodo per aumentare la resa cDNA da singole cellule quantità di mRNA nelle reazioni inverso altrimenti standard di laboratorio trascrizione. La novità risiede nell'utilizzo di un micromixer, che utilizza il fenomeno della microstreaming acustico, di mescolare i fluidi a scale microlitro più efficacemente di agitazione, vortex o triturazione.

Abstract

L'espressione genica correlazione con il comportamento delle cellule è idealmente fatto a livello di singola cellula. Tuttavia, questo non è facilmente ottenibile, perché la piccola quantità di mRNA labili presenti in una singola cella (1-5% di 1-50pg RNA totale, o 0,01 2.5pg mRNA, per cella ¹⁾ degrada soprattutto prima di poter essere trascrizione inversa in una copia stabile cDNA. Ad esempio, utilizzando reagenti di laboratorio e hardware standard, solo un piccolo numero di geni possono essere qualitativamente valutati per cella ^2. Un modo per aumentare l'efficienza dello standard di laboratorio della trascrittasi inversa (RT) reazioni (reagenti standard, cioè in volumi microlitri) comprendente cella singola quantità di mRNA potrebbe essere quella di mescolare più rapidamente i reagenti in modo che il mRNA può essere convertito in cDNA prima che degrada. Tuttavia questo non è banale perché a scale microlitro flusso del liquido è laminare, cioè i metodi attualmente disponibili di miscelazione (es. agitazione, vortex e triturazione) non riescono a produrre sufficiente moto caotico di mescolare in modo efficace i reagenti. Per risolvere questo problema, le tecniche di miscelazione micro-scala devono essere utilizzati ^3,4. Un certo numero di tecnologie di miscelazione microfluidica a base sono state sviluppate con successo che aumentare le rese di reazione RT ^5-8. Tuttavia, le tecnologie microfluidica richiedono hardware specializzato che è relativamente costoso e non ancora ampiamente disponibili. Una soluzione più economica, più conveniente è auspicabile. L'obiettivo principale di questo studio è di dimostrare come l'applicazione di una nuova tecnica "micromixing" per standard di laboratorio reazioni RT composto da singole cellule quantità di mRNA aumenta significativamente il loro rendimento cDNA. Troviamo rendimenti cDNA aumentare di circa 10 100 volte, che consente: (1) maggior numero di geni da analizzare per cella, (2) un'analisi più quantitativa di espressione genica, e (3) rilevazione migliore di bassa abbondanza geni in singole cellule. Il micromixing si basa su acustica microstreaming ^9-12, un fenomeno in cui le onde sonore di propagazione intorno ad un piccolo ostacolo creare un flusso medio vicino l'ostacolo. Abbiamo sviluppato un acustico microstreaming dispositivo basato su ("micromixer") con una semplificazione chiave; microstreaming acustico può essere ottenuto a frequenze audio, garantendo che il sistema è un liquido-aria con un piccolo raggio di curvatura ^13. Il menisco di un volume microlitri di soluzione in un tubo fornisce un adeguato raggio di curvatura piccolo. L'uso delle frequenze audio significa che l'hardware può essere poco costoso e versatile ^13, e gli acidi nucleici e di altri reagenti biochimici non sono danneggiati come possono essere con sonicatori standard di laboratorio.

Protocollo

1. Micromixing una reazione RT

1. Prima di eseguire una reazione RT con micromixing, equilibrare la micromixer alla temperatura desiderata della reazione RT.
   1. Posizionare il micromixer all'interno di un 37 ° C (o la temperatura consigliata dal fornitore RT) incubatore per almeno 1 ora prima dell'inizio della reazione RT.
2. Impostare il mix RT secondo il fornitore di trascrittasi inversa (ad esempio MMTV-RT da Promega, Omniscript da Qiagen) le istruzioni, tranne l'uso di singole cellule quantità di RNA totale di ingresso (per esempio 0.1-1pg/μl), invece del-ng mg quantità raccomandate dai fornitori.
   1. Noi uso standard sterile, ....

Discussione

Il metodo di applicazione della micromixing a standard di laboratorio reazioni RT qui descritto può, ovviamente, coinvolgere mRNA raccolte attraverso qualsiasi mezzo (ad esempio la lisi cellulare, microdissezione laser cattura). Si può altresì comprendere qualsiasi marca o tipi di reagenti RT, qualsiasi temperatura (entro la tolleranza dei materiali della micromixer), e qualsiasi periodo di tempo. Per esempio, abbiamo osservato una migliore resa del DNA da reazioni di RT che comprende casuale esamero o oligo-dT primer. .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
RNA totale è stato isolato da scatto fette surgelati del mouse acutamente preparato adulti mesencefalo
PicoPure RNA Isolation Kit	Arturo, CA, USA	KIT0204	Il kit è ora disponibile da Applied Biosystems
DNA-free DNasi trattamento e reagenti di rimozione	Ambion	AM1906M
Casuale esamero primer	Promega	C1181
AMV-RT	Promega	M5101
dNTP set	Promega	U1240
RNasin Inibitore di ribonucleasi	Promega	N2111
Acqua priva di nucleasi	Promega	P1193
SYBR Verde PCR Master Mix	Applied Biosystems	4309155
HPRT in avanti (20mer): CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT
Hprt inversa (20mer): TAT GTC CCC CGT TGA CTG A
Nurr1 avanti (23mer): CAG CTC CGA CTT TTT AAC TCC AG
Nurr1 inversa (23mer): GGT GAG GTC CGT CAT AAA CTT GA
NanoDrop 1000 Spettrofotometro.	Thermo Scientific
Corbett Rotor Gene RG-6000	Corbett Life Science		Corbett Life Science è stata acquisita da QIAGEN nel luglio 2008