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1. Micromixing una reazione RT
- Prima di eseguire una reazione RT con micromixing, equilibrare la micromixer alla temperatura desiderata della reazione RT.
- Posizionare il micromixer all'interno di un 37 ° C (o la temperatura consigliata dal fornitore RT) incubatore per almeno 1 ora prima dell'inizio della reazione RT.
- Impostare il mix RT secondo il fornitore di trascrittasi inversa (ad esempio MMTV-RT da Promega, Omniscript da Qiagen) le istruzioni, tranne l'uso di singole cellule quantità di RNA totale di ingresso (per esempio 0.1-1pg/μl), invece del-ng mg quantità raccomandate dai fornitori.
- Noi uso standard sterile, priva di nucleasi 200μL tubi con pareti sottili PCR.
- Posizione tubi RT saldamente il micromixer non appena sono pronti per la miscelazione. Il micromixer deve rimanere all'interno della 37 ° C incubatore per tutta la durata della reazione RT.
- Selezionare la corretta frequenza e l'ampiezza di micromixing. In questo esempio si usa 150Hz.
- Accendere il micromixer su e lasciarlo acceso per tutta la durata della reazione RT (60 minuti).
- Accendere il micromixer fuori e prendere i tubi RT una volta la reazione di RT è completa.
- Posizionare i tubi RT su ghiaccio e procedere come di consueto con ulteriori applicazioni quali quantitativa reazione a catena della polimerasi (qPCR o real-time PCR).
2. Rappresentante dei risultati:
Il vantaggio di micromixing nel contesto di reazioni RT è un aumento della resa del DNA rispetto a quando altri metodi di miscelazione (es. agitazione, vortex o triturazione) sono utilizzati. Questo può essere visto, per esempio, su successiva analisi del cDNA Reazione a catena della polimerasi utilizzando quantitativa (qPCR o real-time PCR). Figura 2A illustra gli effetti di micromixing per i primi 5 minuti (blu, "micromixed5") o l'intero 60 minuti (rosso, "micromixed60") rispetto a triturazione della reazione RT immediatamente prima della incubazione RT (nero, "triturazione" ). In questo caso il volume della reazione precedente RT era 25μL e conteneva 2.5pg di RNA totale. tracce qPCR utilizzando primers progettati per rilevare cDNA che rappresentano Nurr-1 mRNA sono indicati sopra, e la media ± SEM del numero di cicli per raggiungere fluorescenza massimo del 50% in 3 ripetizioni di questo stesso esperimento sono tracciate di seguito. L'asterisco indica una differenza statisticamente significativa (ANOVA a una via con Tukey confronti multipli). Si noti che micromixing per i primi 5 minuti della reazione precedente RT ha prodotto una non significativa miglioramento rispetto triturazione micromixing mentre per l'intero 60 minuti di reazione RT precedente ha prodotto un miglioramento significativo rispetto triturazione, la cui entità è stata pari a circa 15 qPCR cicli, in media.
Il vantaggio di micromixing può essere visto anche in curva di fusione analisi dei prodotti qPCR successive ottenuti. Nell'esperimento illustrato nella figura 2B, micromixing per l'intero 60 minuti di reazione precedente RT portato ad un segnale qPCR consistente in campioni di duplicato (Figura 2BA, 2 tracce di rosso), mentre micromixing per i primi 5 minuti o triturazione prodotto solo qPCR incoerente tracce (Figura 2BA, 2 tracce blu e 2 tracce nere, rispettivamente). Le tracce grigio sono controlli negativi ("neg.") In cui cDNA è stato lasciato fuori della reazione qPCR. Quando i prodotti qPCR da questo esperimento sono state denaturate dal rampa loro temperatura (analisi di fusione cioè curva) era evidente che determinati prodotti PCR (cioè un amplicone che era identica a quella ottenuta quando le concentrazioni molto più elevato di mRNA sono stati trascrizione inversa e amplificata da qPCR, dati non riportati) erano presenti solo le seguenti reazioni RT che erano stati micromixed per 60 minuti (Figura 2Bb, 2 tracce di rosso). Tutti gli altri (cioè micromixed5, triturazione e controlli negativi) di produzione di beni amplicone alternative (ad esempio dimeri primer).
Figura 1. Diagramma di flusso del protocollo per l'applicazione di standard di laboratorio micromixing reazioni RT. Descrizioni più dettagliate del principio fisico coinvolto, la micromixer e come costruire un in-house micromixer sono forniti riferimenti 13,14
Figura 2. Rappresentante dati qPCR illustrando i vantaggi della micromixing applicata al precedente reazioni RT composto da singole cellule quantità di mRNA in altro modo standard di laboratorio reazioni RT. Un esempio tracce qPCR rilevazione del DNA mRNA rappresenta la codifica Nurr-1 gene. Le reazioni precedente RT contenute 2.5pg di RNA totale in un volume di 25μL e sono stati eseguiti in un incubatore a 37 ° C per 60 minuti. Reazioni RT sono state remixate da triturazione del RT mix prima di incubazione (tracce nere, "triturazione"), micromixed durante i primi 5 minuti della reazione RT (tracce blu, "micromixed5") o micromixed per l'intero 60 minuti di reazione RT (tracce rosse, "micromixed60" ). Media ± SEM del numero di cicli necessari per raggiungere qPCR fluorescenza massimo del 50% sono riportati qui di seguito per n = 3 ripetizioni di questo esperimento. Asterisco indica una differenza significativa (ANOVA a una via con Tukey confronti multipli). B Un altro esperimento qPCR esaminando Nurr-1 prodotto cDNA, questa volta a seguito di reazioni RT contenente 25pg di RNA totale in un volume di 25μL. tracce qPCR (a), così come l'analisi della curva di fusione dei prodotti qPCR ottenuti (b) sono indicati per le diverse condizioni di miscelazione. Controlli negativi in cui è stato inserito nessun cDNA nella reazione precedente RT sono inclusi anche (tracce grigie, "neg."). Reazioni RT con concentrazioni molto più elevate di mRNA sono stati eseguiti e prodotti picchi curva di fusione (dati non riportati) identici a quelli (b) per micromixed60 (tracce rosse) campioni.