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Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Preparazione delle membrane cerebrali del topo
- Decapitare il topo utilizzando un apparecchio a ghigliottina e sezionare rapidamente il cervello (in <1 minuto, se possibile, per ridurre al minimo i cambiamenti di palmitoilazione che possono verificarsi durante la procedura di dissezione). Omogeneizzare immediatamente in 10 mL di tampone di omogeneizzazione ( Tabella 1) in un omogeneizzatore di vetro (~12 colpi) su ghiaccio.
- Centrifugare i lisati per 15 minuti a 1.400 x g a 4 °C. Trasferire il surnatante in una nuova provetta con ghiaccio. Risospendere il pellet (~6 colpi) in un volume uguale di tampone di omogeneizzazione e centrifugare a 710 x g per 10 minuti a 4 °C.
- Combinare i surnatanti del passaggio 1.2 e centrifugare a 40.000 x g per 20 minuti a 4 °C.
- Scartare il surnatante (frazione citosolica) e risospendere la frazione di membrana pellettata (P2) nel tampone di omogeneizzazione.
NOTA: I campioni possono essere congelati e conservati a -80 °C per un uso successivo.
- Eseguire un test dell'acido bicinchoninico (BCA) per quantificare i livelli proteici. Per il test Acil-PEGyl exchange gel-shift (APEGS), iniziare con ~100-200 mg di proteina (massimo 250 mg) in un volume di 470 μL di tampone A (Tabella 1) in una provetta da 1,5 mL. Sonicare e centrifugare a >13.000 x g per 10 minuti a 25 °C per rimuovere le proteine insolubili. Trasferire la proteina solubilizzata in una nuova provetta da 1,5 mL.
2. Saggio di acil-PEGyl exchange gel-shift (APEGS)
- Interrompe i legami disolfuro e blocca le cisteine libere.
- Rompere i legami disolfuro incubando in 25 mM di tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP; 25 μL, aggiunta da una soluzione madre); Tabella 1) per 60 min a 55 °C.
- Bloccare le cisteine libere con 50 mM di N-etilmaleimmide (NEM; 12,5 μL, aggiunte da una soluzione madre; Tabella 1) a temperatura ambiente per 3 ore.
NOTA: La reazione può essere prolungata durante la notte.
- Eseguire la precipitazione del metanolo cloroformio (CM).
- Trasferire la soluzione proteica da una provetta da 1,5 mL a una provetta in polipropilene o vetro che può essere centrifugata in un rotore a secchiello oscillante a velocità modesta. Una provetta da 5 ml è l'ideale. Aggiungere quattro volumi (2 mL) di metanolo (MeOH) e agitare brevemente.
- Aggiungere due volumi (1 mL) di cloroformio e agitare brevemente.
- Aggiungere tre volumi (1,5 mL) di acqua deionizzata (dH2O) e agitare brevemente.
- Centrifugare i campioni a 3.000 x g per 30 minuti a 25 °C in un rotore a secchiello oscillante.
- Rimuovere con cautela e gettare la fase superiore.
- Aggiungere 3 volumi (1,5 mL) di MeOH e mescolare delicatamente ma accuratamente, facendo attenzione a non frammentare il pancake proteico opaco.
- Centrifugare a 3.000 x g per 10 minuti a 25 °C in un rotore a secchiello oscillante.
- Utilizzando una pipetta sierologica di vetro, rimuovere la maggior parte possibile della fase superiore senza disturbare il pancake proteico.
- Sciacquare accuratamente il pellet con 1 ml di MeOH.
- Asciugare il pellet all'aria per almeno 10 minuti.
NOTA: Il pellet essiccato può essere conservato a -20 °C.
- Eseguire la scissione dei legami palmitoil-tioestere con idrossilammina (NH2OH, HAM).
- Risospendere il precipitato proteico in 125 μL di tampone A e sonicare brevemente. Centrifugare a >13.000 x g per 10 minuti a 25 °C per rimuovere il materiale insolubile. Trasferire la proteina solubilizzata in una nuova provetta da 1,5 mL.
- Aggiungere 375 μl di tampone H (HAM+; Tabella 1) o buffer T (HAM-; Tabella 1) e incubare i campioni per 60 minuti a 25 °C.
- Ripetere la precipitazione CM descritta al punto 2.2.
NOTA: Il pellet essiccato può essere conservato a -20 °C.
- Aggiungere mPEG alle cisteine non protette.
- Risospendere il pellet in 100 μL di tampone A contenente 10 mM di TCEP. Trasferire in una provetta da 1,5 mL.
NOTA: È normale che si sia verificata una significativa perdita di proteine durante le fasi di precipitazione del CM. Tutti i passaggi successivi verranno eseguiti in una provetta da 1,5 mL, limitando il volume delle proteine a un massimo di ~120-130 μL. Ciò ridurrà la perdita di proteine durante la precipitazione finale del CM.
- Aggiungere 20 mM di mPEG-5k (25 μL, aggiunti da una soluzione madre; Tabella 1) al campione di proteine e miscelare mediante pipettaggio. Incubare per 60 minuti a 25 °C con rotazione end-over-end.
- Per rimuovere mPEG-5k non incorporato, eseguire la precipitazione CM come descritto al punto 2.2 utilizzando questi volumi aggiustati: 4 volumi di MeOH (500 μL), 2 volumi di cloroformio (250 μL) e 3 volumi di dH2O (375 μL). Centrifugare a >13.000 x g per 10 minuti a 25 °C.
- Rimuovere con cura la fase superiore come prima, evitando la frittella densa e flocculante. Aggiungere 1 ml di MeOH e mescolare delicatamente ma accuratamente. Centrifugare a >13.000 x g per 10 minuti a 25 °C.
- Rimuovere con cautela il surnatante e sciacquare il pellet con 1 mL di MeOH. Centrifugare a >13.000 x g per 10 minuti a 25 °C. Pellet essiccato all'aria.
NOTA: Il pellet essiccato può essere conservato a -20 °C.
- Risospendere il pellet essiccato in 50 μL di tampone A (senza TCEP o altri agenti riducenti).