Fabbricazione di microsfere polimeriche a rilascio di amiloide-beta per la modellazione della malattia di Alzheimer

Abstract

Fonte: Almari, B., et al. Fabbricazione di microsfere di alginato secernente amiloide-β per l'uso nella modellazione della malattia di Alzheimer. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video mostra un metodo per fabbricare microsfere polimeriche che incapsulano cellule neurotossiche secernenti amiloide-beta. La sospensione cellula-polimero viene lavorata attraverso un dispositivo di fabbricazione di microsfere, con gelificazione del polimero ottenuta tramite reticolazione del calcio, formando microsfere sferiche attorno alle cellule. Il polimero consente la proliferazione cellulare consentendo un rilascio controllato e a lungo termine di amiloide-beta, simulando il suo accumulo nella malattia di Alzheimer.

Protocollo

1. Preparativi

1. Preparare 100 mL di soluzione madre di alginato ~4% (p/v).
   1. Pesare 4,4 g di sale sodico di alginato e aggiungere la polvere secca a 100 mL di soluzione salina tamponata con HEPES (HBS, 20 mM di acido idrossietilpiperazina etano solfonico [HEPES] (0,477 g) con 150 mM di NaCl (0,877 g) in acqua deionizzata che consente l'idratazione.
   2. Utilizzare un agitatore magnetico a ~500 giri al minuto (rpm) e riscaldare fino a 50 °C per consentire la completa idratazione dell'alginato.
      nota: L'alginato può aver bisogno di una o due ore per essere completamente idratato. Per risparmiare tempo, la soluzione di alginato può essere preparata un giorno prima del protocollo di incapsulamento e conservata a 4 °C fino al giorno successivo. Quando l'alginato è stato refrigerato, riscaldare delicatamente a 37 °C utilizzando un bagnomaria o una piastra riscaldante e agitare con un agitatore magnetico immediatamente prima dell'uso.
   3. Filtrare sterile la soluzione di alginato utilizzando un filtro in polietersulfone (PES) con pori da 0,22 μm prima dell'uso. Si consiglia un filtraggio a 37 °C per consentire un facile flusso dell'alginato. La viscosità aumenterà se la temperatura viene lasciata scendere.
2. Preparare 1.000 mL di CaCl_{0,5 M 2}.
   1. Pesare 55,49 g di CaCl₂ anidro e sciogliere in 1.000 mL di HBS (20 mM di HEPES e 150 mM di NaCl in 1.000 mL di acqua deionizzata).
   2. Filtro sterile con filtro PES con pori da 0,22 μm.
3. Preparare 100 mL di miscela di dissoluzione.
   1. Preparare una soluzione di HEPES 100 mM (23,83 g) e 500 mM di citrato trisodico diidrato (147,05 g) in soluzione salina tamponata con fosfato.
   2. Regolare a pH 7,4 utilizzando NaOH o HCl.

2. Configurare il sistema di incapsulamento

1. Pulire la cappa a flusso laminare.
   1. Sterilizzare la cappa a flusso laminare contenente l'incapsulatore utilizzando l'esposizione ai raggi UV, seguita da una spruzzatura con una soluzione di etanolo al 70% v/v.
   2. Lavare il sistema incapsulatore con 10 mL di soluzione di etanolo al 70% v/v seguiti da 10 mL di acqua deionizzata sterile.
   3. Collegare l'ugello da 300 μm e ripetere il passaggio 2.1.2.
   4. Spruzzare il flacone contenente la soluzione di alginato filtrato, il flacone contenente la soluzione di cloruro di calcio filtrato e tutti gli strumenti, le attrezzature e le piastre di coltura vuote che verranno utilizzati con una soluzione di etanolo al 70% v/v e inserirli nella cappa a flusso laminare. Prima dell'uso, riaccendere una luce UV per 30 minuti per sterilizzare accuratamente.
   5. Preparare un becher per rifiuti riempito con una soluzione disinfettante di grado biologico e posizionare il becher nella cappa.
   6. Riempire un becher con 100 mL di soluzione sterile di CaCl₂ (acquosa) e aggiungere un agitatore magnetico. Impostare la velocità di agitazione a 100 giri/min. Posizionare il becher su una piattaforma magnetica ad un'altezza di 18 cm dalla punta dell'ugello. Questo becher servirà per raccogliere le perle di alginato e permetterne la gelificazione.
2. Preparare le cellule per l'incapsulamento.
   1. Rimuovere le cellule dall'incubatore e staccarle dal pallone quasi confluente utilizzando una soluzione di acido tripsin-etilendiamminotetraacetico allo 0,25% (EDTA) e incubare a 37 °C per 5-10 minuti.
   2. Isolare un campione per stimare la densità delle cellule, quindi centrifugare le celle rimanenti a 1.000 giri/min per 5 minuti per ottenere un pellet di cellule.
   3. Risospendere il pellet in HBS (20 mM HEPES e 150 mM NaCl) per raddoppiare la concentrazione finale di cellule desiderata (ad esempio, per una concentrazione finale di 1,5 x 10⁶ cellule/mL, risospendere le cellule in HBS per ottenere una concentrazione di 3 x 10⁶ cellule/mL).
   4. In una provetta da centrifuga da 50 mL, miscelare la sospensione cellulare in un rapporto 1:1 con una soluzione di alginato ~4% (p/v) per ottenere una sospensione finale contenente la concentrazione cellulare desiderata (ad esempio, 1,5 x 10⁶ cellule/mL) in una soluzione di alginato ~2% (p/v).
3. Impostare i parametri di incapsulamento.
   1. Impostare la velocità della macchina incapsulatrice alla velocità massima di estrusione (8,9 mL/min), la tensione a 1,0 kV e la frequenza a 5.500 Hz.
      nota: Questi parametri sono stati precedentemente ottimizzati per ottenere microsfere di 550 μm di diametro.

3. Fabbricazione

1. Fabbricare le microsfere.
   1. In una siringa da 20 mL, caricare 5 mL della sospensione di cellule-alginato e collegare una siringa all'incapsulatore.
   2. Avviare l'incapsulatore attivando il flusso che spingerà la sospensione cellula-alginato attraverso l'alimentatore. Un flusso di goccioline verrà estruso attraverso l'ugello.
   3. Raccogliere il primo 1 mL nel becher dei rifiuti per evitare il flusso iniziale non uniforme.
   4. Continuare a far scorrere i restanti 4 mL lasciando che le goccioline cadano nel bagno di gelificazione CaCl₂. Ogni millilitro può essere fatto funzionare separatamente (ma in successione) e raccolto in quattro diversi bagni di gelificazione, se necessario.
      nota: A contatto con il bagno di gelificazione, l'alginato nelle goccioline si lega istantaneamente con gli ioni di calcio nel bagno di gelificazione e forma microsfere sferiche.
   5. Dopo un minuto, rimuovere il becher di gelificazione dalla piattaforma magnetica e lasciare riposare le microsfere per altri 4 minuti senza agitare (tempo necessario per consentire la gelificazione completa attraverso le microsfere a temperatura ambiente).
2. Recupera le microsfere.
   1. Rimuovere eventuali detriti o artefatti di alginato di grandi dimensioni utilizzando un paio di pinzette sterili, quindi utilizzare una pipetta di plastica sterile per trasferire in un filtro a rete da 74 μm per recuperare le microsfere dal bagno di gelificazione.
   2. Trasferire le microsfere in una provetta da centrifuga utilizzando il terreno di coltura appropriato e lasciarle equilibrare per 5 minuti nel terreno di coltura cellulare.
   3. Trasferire in un pallone, una piastra o una piastra di Petri per l'incubazione e ulteriori esperimenti.
      nota: Il bagno di gelificazione non deve essere riutilizzato.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0.22 um filtro PES	Merck, Regno Unito	SLGP033RS
Filtro a maglie da 74 mm con inserto Netwell da 15 mm	Constar, Stati Uniti	#3477
Acido alginico sale sodico da alghe brune	Sigma-Aldrich,uk	A0682
Cloruro di calcio	Sigma-Aldrich,uk	C1016
CellTiter96 AQueous One Solution saggio di proliferazione cellulare	Promega, Stati Uniti	G3580
Incapsulatore	Inotech	IE-50	Numero di serie 05.002.01-2005
HEPES	Sigma-Aldrich,uk	H4024
Soluzione salina tamponata con fosfato	Sigma-Aldrich,uk	D1408
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich,uk	433209
Trispdium citrato diidrato	Sigma-Aldrich,uk	W302600-K
Soluzione tripsina-EDTA	Sigma-Aldrich,uk	T4049