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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dalla revisione veterinaria di JoVE
Nota: Inizia identificando la popolazione murina target. In studi precedenti, sono stati utilizzati solo topi maschi wild-type C57/Bl6. Tuttavia, possono essere utilizzati anche vari topi transgenici o knockout. Si noti che le coordinate stereotassiche si basano sull'anatomia C57/Bl6. Si consiglia a ciascun utente di verificare inizialmente la localizzazione del tratto nella sostanza bianca.
1. Induzione dell'ictus della sostanza bianca - Approccio angolato mediale
- Iniziare preparando una pipetta di vetro estratta utilizzando un tubo capillare da 0,5 mm con un diametro distale compreso tra 15 e 25 μm.
- Preparare un'aliquota sterile da 10 μl di L-Nio (N(5)-(1)-imminoetil-L-ornitina cloridrato) a 27,4 mg/ml (130 μM) in soluzione fisiologica sterile allo 0,9%.
- Pre-riempire la pipetta di vetro estratta con un piccolo volume di L-Nio (2-5 μl) fissando la pipetta di vetro al tubo collegato a una linea del vuoto. Appoggiare la pipetta sul piano di lavoro e inserire l'estremità estratta nella soluzione di L-Nio.
- Applicare il vuoto fino a riempire almeno 2 mm della parte da 0,5 mm della pipetta. Spegnere l'aspirapolvere ed estrarre la pipetta. Mettilo da parte fino al passaggio 1.12.
- Posizionare il topo in una camera di induzione e indurre l'anestesia del topo utilizzando isoflurano standard al 32% fatto fluire attraverso un vaporizzatore (5 L/min inalato con 5 L/min di ossigeno e 0,5 L/min di azoto) per 1 minuto o fino a quando non è profondamente anestetizzato. Trasferire il mouse in un apparecchio stereotassico dotato di microscopio stereotassico. Fornire un'anestesia di mantenimento utilizzando isoflurano al 32% fatto fluire attraverso un vaporizzatore (2 L/min inalato con 5 L/min di ossigeno e 0,5 L/min di azoto) e un cono nasale. Controllare la profondità dell'anestesia con un pizzico di punta.
- Regolare il braccio di iniezione a 36°.
- Fissare un portapipetta di vetro estratto all'estremità distale di un sistema di iniezione a bassa pressione a basso volume e collegarlo al braccio di iniezione della configurazione stereotassica.
- Rivestire i baffi dell'animale anestetizzato con vaselina e applicare un unguento lacrimale artificiale su entrambi gli occhi. Preparare un campo chirurgico sterile posizionando un telo sterile sopra la testa dell'animale con un'apertura di 5-10 cm sopra la testa. Preparare una superficie chirurgica asettica radendo il pelo sovrastante il cranio. Pulire il cuoio capelluto con betadina alternata e tamponi imbevuti di alcol al 70%.
- Praticare un'incisione del cuoio capelluto sulla linea mediana di 1,5 cm con forbici sottili sterili per esporre la superficie del cranio. Asciugare il cranio con un batuffolo di cotone sterile e, utilizzando un microscopio stereotassico con ingrandimento 1-3X, rimuovere il tessuto periostale sovrastante utilizzando uno strumento sterile per micropunti.
- Contrassegna il Bregma come punto di riferimento utilizzando un pennarello a punto fine.
- Praticare una craniotomia ellittica da 2 mm utilizzando una punta chirurgica sterile a punta fine che inizia posteriormente al Bregma e si estende anteriormente appena a sinistra della linea mediana. Rimuovere i frammenti ossei e i tessuti molli sovrastanti in modo che la corteccia cerebrale possa essere visualizzata.
- Mantenere umido il campo chirurgico e la superficie corticale applicando in modo intermittente gocce di soluzione fisiologica sterile.
- Applicare una pipetta di vetro estratta al braccio dell'iniettore dell'apparecchio stereotassico. Allineare l'estremità distale della pipetta con il Bregma e azzerare le coordinate stereotassiche.
- Far avanzare la pipetta fino alle prime coordinate anteriore/posteriore (A/P) e mediale/laterale (M/L) fornite nella Tabella 1.
- Far avanzare la pipetta sulla superficie corticale e azzerare la misurazione dorsale/ventrale (D/V).
- Passare lentamente la pipetta nel cervello fino a raggiungere la prima coordinata D/V nella Tabella 1.
- Utilizzando un sistema di iniezione a pressione a basso volume impostato a 20 psi per impulsi di 20 msec, iniettare 100 nl di L-Nio nel cervello e attendere 5 minuti per prevenire il reflusso lungo il percorso della pipetta.
- Utilizzare un reticolo calibrato nell'oculare del microscopio stereotassico e un ingrandimento di 3X.
- Di conseguenza, spostare un totale di 0,100 mm3 (0,5 mm di lunghezza in una pipetta di 0,5 mm di diametro, corrispondente a 100 nl) dalla pipetta di vetro estratta per ogni serie di coordinate. Utilizzando un reticolo, misura e standardizza poiché ogni configurazione varia a seconda dell'ingrandimento e delle scale utilizzate.
- Per una misurazione accurata del volume durante ogni iniezione, avvicinare la pipetta angolata con il microscopio lateralmente in modo che il menisco del fluido d'aria abbia una vista sagittale. Il menisco deve apparire sullo stesso piano focale delle pareti interne ed esterne della pipetta.
- Estrarre lentamente la pipetta e ripetere i passaggi 1.13-1.16.3 alla seconda e terza serie di coordinate fornite nella Tabella 1.
- Dopo l'iniezione finale, rimuovere la pipetta e posizionare una quantità sufficiente di cera ossea per riempire il sito della craniotomia. Approssimare i bordi della ferita del cuoio capelluto e legare con adesivo dermico.
- Iniettare 0,1 ml di marcaina allo 0,5% nei margini della ferita utilizzando un ago sterile da 30 G per prevenire il dolore locale associato all'incisione del cuoio capelluto.
- Riportare l'animale in stabulazione e somministrare antibiotici post-operatori (0,48 mg/ml di trimetoprim-sulfametossazolo o 0,5 mg/ml di levofloxacina) nell'acqua potabile per 5 giorni.
