1. Preparazione della parete del corpo
NOTA: La preparazione delle pareti del corpo larvale del terzo stadio (per lo studio dei NMJ che innervano i muscoli della parete corporea) è stata eseguita come descritto in precedenza ma con alcune modifiche.
- dissezione
- Aumentare gli stock di mosche e le croci a 25 °C per cinque o sei giorni utilizzando le procedure standard.
- Raccogli le larve striscianti del terzo stadio da fiale o bottiglie usando una pinza fine.
- Lavare le larve in una piccola capsula di Petri contenente soluzione salina tampone fosfato (PBS) per rimuovere eventuali particelle di cibo.
- Posiziona una singola larva su un disco di sylgard e immergila in alcune gocce di PBS ghiacciato. L'uso di PBS ghiacciato aiuterà a stordire la larva, rendendola più facile da manipolare. Durante la dissezione, assicurarsi che il preparato sia sempre immerso nel PBS per evitare che si asciughi.
- Posizionare la larva con il lato dorsale rivolto verso l'alto in modo che i due tratti tracheali siano visibili al microscopio da dissezione (Figura 1A). Usando la pinza per afferrare uno spillo minuzioso, inchiodare la larva all'estremità posteriore vicino agli spiracoli (Figura 1B). Con un altro spillo, forare la cuticola all'estremità anteriore vicino ai ganci della bocca. Allungare delicatamente la larva nel senso della lunghezza, quindi fissarla (Figura 1B).
- Usando le forbici per microdissezione, pizzica l'estremità posteriore vicino al perno per creare una piccola apertura. L'incisione dovrebbe essere abbastanza superficiale da passare solo attraverso la cuticola.
- Posizionando la punta della lama inferiore delle forbici nell'incisione, tagliare lungo l'intera lunghezza della linea mediana dorsale tra i due tratti tracheali (Figura 1C). Puntare le lame delle forbici leggermente verso l'alto durante il taglio per evitare di danneggiare i muscoli ventrali della parete del corpo.
- Praticare una piccola incisione orizzontale leggermente anteriormente al perno posizionato posteriormente (Figura 1C). Praticare un'altra incisione simile leggermente posteriore al perno posizionato anteriormente (Figura 1C). Le incisioni dovrebbero passare solo attraverso la cuticola.
nota: Le tre incisioni dei passaggi 1.1.7 e 1.1.8 combinate dovrebbero assomigliare a un "
" una volta completato, cioè dovrebbe essere prodotto un lembo sinistro e destro sul lato dorsale del corpo larvale.
- Pulisci accuratamente gli organi interni con il forcipe. L'aggiunta di alcune gocce energiche di PBS aiuterà a spostare gli organi fuori dal corpo larvale, facilitando così la loro rimozione. Evita di colpire il corpo larvale in quanto causerebbe danni ai muscoli della parete corporea.
- Aprire il corpo larvale e fissare gli angoli verso il basso (Figura 1D). Durante l'appuntamento, allungare la parete del corpo sia orizzontalmente che verticalmente per formare un rettangolo uniformemente teso (vedere la Figura 1G per la forma), facendo attenzione a non strappare i muscoli della parete del corpo durante il processo.
- Terminare la rimozione di tutti gli organi interni rimanenti (Figura 1E).
- Fissazione e permeabilizzazione
- Immergi le pareti del corpo appuntate in diverse gocce di Bouin's Solution. Incubare per 15 minuti con ghiaccio. In alternativa, utilizzare il 4% di paraformaldeide (PFA) come fissativo alternativo; Incubare per 30 min.
- Risciacquare tre volte con soluzione salina tampone fosfato con Triton (PBT).
- Utilizzando una pinza fine, rimuovere con cura i perni e trasferire le pareti del corpo per gli angoli in una provetta da microcentrifuga siliconata da 0,65 ml.
- Conservare le pareti del corpo in PBT a 4 °C fino al momento dell'uso del PLA. Per ottenere risultati ottimali, iniziare l'immunocolorazione delle pareti del corpo entro un giorno o due dalla dissezione.
nota: Per risparmiare sui reagenti e garantire che tutte le pareti del corpo siano trattate allo stesso modo durante il test, è possibile inserire diversi genotipi in un'unica provetta. I genotipi possono essere distinti tagliando gli angoli delle pareti del corpo in modo diverso (vedi Figura 1F per esempio).
2. Immunoistochimica
NOTA: L'immunocolorazione delle pareti del corpo larvale del terzo stadio è stata eseguita come descritto in precedenza, ma con alcune modifiche.
nota: Eseguire tutti i passaggi a temperatura ambiente e con leggera agitazione, se non diversamente specificato.
- inceppamento
- Lavare le pareti del corpo con PBT tre volte per 10 minuti ciascuna.
- Bloccare con albumina sierica bovina all'1% (BSA) per 1 ora.
- Immunocolorazione
- Incubare le pareti corporee con anticorpi primari di topo e coniglio contro le due proteine di interesse (diluite in BSA all'1%) per 2 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 °C. In questo caso, utilizzare un anti-Dlg di topo 1:10 (Dlg = dischi grandi) e un anti-HtsM di coniglio 1:250 (HtsM: mutante Hu-li tai shao). Possono essere inclusi anche anticorpi contro marcatori che non sono prodotti nel topo o nel coniglio, ad esempio, utilizzare 1:200 anti-Hrp di capra (Hrp = perossidasi di rafano) per delineare le membrane neuronali.
- Lavare con PBT tre volte per 10 minuti ciascuna.
- Incubare con anticorpi secondari coniugati con fluorofori per rilevare i marcatori (diluiti in BSA all'1%) per 2 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 °C. Poiché il segnale PLA viene successivamente visualizzato con un fluoroforo rosso, è necessario utilizzare un altro fluoroforo per rilevare il marcatore, ad esempio utilizzare un anti-capra coniugato con isotiocianato di fluoresceina (FITC) 1:200 per rilevare l'anticorpo anti-Hrp di capra. A causa dell'uso di reagenti sensibili alla luce, da questo momento in poi tenere le provette al buio.
nota: Il kit utilizzato consente di eseguire il PLA tra gli anticorpi primari sollevati nel topo e nel coniglio, con il segnale visualizzato sul canale rosso al microscopio confocale. Se lo si desidera, sono disponibili altri kit che consentono di eseguire il test con anticorpi primari allevati in altre specie e di visualizzare il segnale su altri canali.
3. Saggio di legatura di prossimità
NOTA: Esegui tutti i passaggi a temperatura ambiente e con una leggera agitazione se non diversamente specificato.
- Sonde PLA
- Lavare le pareti del corpo con PBT tre volte per 10 minuti ciascuna.
- Incubare con sonde PLA (diluizione 1:5 ciascuna in 1% BSA) per 2 ore a 37 °C. In questo caso, utilizzare 40 μl di sonda PLA anti-mouse MINUS, 40 μl di sonda PLA anti-coniglio PLUS e 120 μl di BSA all'1% per garantire la corretta immersione e miscelazione di 5-10 pareti corporee. Una diluizione fino a 1:25 delle sonde PLA può ancora portare a un adeguato rapporto segnale/rumore (ad esempio, per questo esperimento).
- Legatura
- Lavare le pareti del corpo con il tampone di lavaggio A due volte per 5 minuti ciascuna.
- Incubare con la soluzione di legatura (diluizione 1:40 della ligasi nel tampone di legatura) per 1 ora a 37 °C. In questo caso, utilizzare 5 μl di ligasi, 40 μl di 5 tampone di legatura e 155 μl di acqua ad alta purezza per garantire la corretta immersione e miscelazione di 5-10 pareti del corpo.
- amplificazione
- Lavare le pareti del corpo con il tampone di lavaggio A due volte per 2 minuti ciascuna.
- Incubare con la soluzione di amplificazione (diluizione 1:80 della polimerasi nel tampone di amplificazione) per 2 ore a 37 °C. In questo caso, utilizzare 2,5 μl di polimerasi, 40 μl di 5 tampone di amplificazione e 157,5 μl di acqua ad alta purezza per garantire la corretta immersione e miscelazione di 5-10 pareti del corpo.
- Preparazione per l'imaging
- Lavare le pareti del corpo con il tampone di lavaggio B due volte per 10 minuti ciascuna.
- Lavare con 0,01x Wash Buffer B una volta per 1 min.
- Equilibrare in alcune gocce di soluzione di montaggio per almeno 30 minuti prima del montaggio, oppure conservare per una notte a 4 °C.
- Utilizzando una pinza fine, trasferire con cura le pareti del corpo su uno scivolo a piattaforma con le cuticole rivolte verso il basso. Posizionare le pareti del corpo in file e con lo stesso orientamento entro una o due gocce di montaggio. Posizionare un vetrino coprioggetti da 22 mm x 40 mm sulla preparazione facendo attenzione a non generare bolle d'aria, quindi sigillare il vetrino con smalto trasparente.
- Conservare i vetrini al buio a -20 °C fino al momento dell'imaging confocale.
