Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
NOTA: Il protocollo descrive una procedura di taglio cerebrale biemisferico simmetrico per la valutazione cerebrale post mortem finalizzata per studi neuropatologici nell'uomo. Saranno escluse descrizioni dettagliate degli apparecchi, degli strumenti, dei materiali e delle forniture necessarie per il taglio del cervello umano. I materiali e le forniture per le dissezioni cerebrali sono selezionati a discrezione del singolo ricercatore e si basano su strumenti di autopsia consentiti o approvati presso ciascun istituto di ricerca. Il set minimo di strumenti e materiali necessari per questa procedura è descritto nella Tabella Materiali/Attrezzature. Le procedure di sezionamento specifiche e le precauzioni per le sospette malattie cerebrali trasmissibili, come la CJD umana, esulano dagli scopi di questo manoscritto e sono disponibili da altre fonti.
1. Taglio del cervello biemisferico simmetrico
Nota: Assicurati che il cervello abbia ricevuto la necessaria fissazione tissutale (utilizzando, ad esempio, formalina neutra al 10%) per un periodo di due o tre settimane, a seconda delle condizioni periagonali, metaboliche (cioè pH) e di conservazione dei tessuti (cioè temperatura). Tuttavia, per gli studi di correlazione imaging-patologia, è stato suggerito un periodo di fissazione più lungo (>5,4 settimane).
- Posizionare il cervello su una superficie piana di fronte all'investigatore, con i poli frontali diretti nella direzione opposta rispetto all'investigatore.
- Posizionare il cervello in modo da consentire una visualizzazione completa e chiara di tutte le circonvoluzioni corticali e dei solchi dell'intero cervello (Figura 1a).
- In primo luogo, cercare anomalie meningee, asimmetrie emisferiche macroscopiche (possibili indicatori di fenomeni focali, lobari o emisferici generalizzati di atrofia), lesioni tissutali macroscopiche (ad esempio, tumori o ernie), malformazioni congenite, anomalie dei vasi e qualsiasi altra possibile anomalia o presentazione insolita della superficie cerebrale><.
nota: Per descrizioni dettagliate di come valutare un cervello umano, fare riferimento ai libri di testo di neuropatologia e ai manuali di autopsia disponibili in commercio.
2. Sequenza del protocollo
- Affrontare i poli frontali lontano dall'investigatore, con gli aspetti superficiali degli emisferi (telencefalo) rivolti verso l'investigatore. Scatta tutte le foto digitali necessarie in ogni caso particolare per documentare possibili macro-anomalie e per tenere conto di eventuali considerazioni clinico-neuroanatomiche e post-taglio. Chiedi a un assistente di ricerca di scattare fotografie digitali perpendicolarmente al cervello per catturare l'intera superficie corticale (Figura 1a - c).
- Segnare il giro corticale pre e postcentrale usando inchiostro o aghi colorati prima di tagliare il cervello (Figura 1b).
nota: Questa procedura facilita un riconoscimento più immediato delle cortecce primarie motorie e somatosensoriali dopo il taglio.
- Ruota il cervello di 180 gradi mantenendolo rivolto nella stessa direzione (cioè, i poli frontali rivolti lontano dall'investigatore). Ispezionare attentamente la base del cervello. Prestare particolare attenzione alle condizioni dei sistemi cerebrovascolari (cioè le arterie basilari e vertebrali e il circolo di Willis) e dei nervi cranici ai livelli di uscita/ingresso del tronco encefalico. Gestire i bulbi olfattivi e i tratti con particolare attenzione per evitare lacerazioni dei tessuti dovute alla loro estrema fragilità.
- Scatta tutte le foto digitali necessarie in ogni caso particolare per documentare possibili macro-anomalie e per tenere conto di eventuali considerazioni clinico-neuroanatomiche e post-taglio. Chiedi a un assistente di ricerca di scattare fotografie digitali perpendicolarmente al cervello per catturare l'intera superficie corticale e del tronco encefalico.
- Rivolto verso la base del cervello e usando un bisturi, tagliare il tronco encefalico trasversalmente a livello della parte superiore del ponte (il più vicino possibile alla base del cervello). Ispezionare attentamente il SN (cioè per verificare la presenza di pallore) e altre strutture vicine. Prendi nota, possibilmente utilizzando un dispositivo di registrazione audio, di qualsiasi aspetto insolito del cervello rispetto a un cervello normale.
- Anche in questo caso, ruotare il cervello di 180 gradi e, utilizzando un coltello affilato, separare i due emisferi tagliando il corpo calloso centralmente attraverso la fessura longitudinale mediale e seguendo una direzione fronto-occipitale. Ispezionare ogni lato di ciascun emisfero per possibili anomalie (ad esempio, ingrossamenti ventricolari, malformazioni, rammollimento dei tessuti, tumori, ecc.). Vedere la Figura 2a.
- Scatta tutte le foto digitali necessarie in ogni caso particolare per documentare possibili macro-anomalie e tenere conto di eventuali considerazioni clinico-neuroanatomiche e post-taglio. Chiedi a un assistente di ricerca di scattare fotografie digitali perpendicolarmente al cervello per catturare l'intera superficie corticale. Nota qualsiasi caratteristica cerebrale insolita rispetto a un cervello normale.
- Posizionare i due emisferi in piano, sdraiati sulle loro facce mediali, con i lobi frontali rivolti lontano dall'investigatore, come mostrato nella Figura 2b. Posizionarli in modo che i loro centri si tocchino (anche in caso di marcata asimmetria emisferica).
- Usando un coltello affilato, tagliare manualmente entrambi gli emisferi cerebrali, partendo dai poli frontali e spostandosi verso i poli occipitali per tutta la lunghezza degli emisferi. Ottenere due serie di blocchi di tessuto cerebrale spessi 1 cm (circa 18 lastre per ogni emisfero).
- Posizionare le lastre cerebrali in una sequenza anatomicamente organizzata (direzione fronto-occipitale) su una superficie piana separata. Utilizzare una superficie bianca con un righello stampato su di essa per un migliore contrasto durante la fotografia. Esporre le due serie di lastre cerebrali in modo anatomicamente simmetrico (direzione fronto-occipitale), assicurandosi che le loro superfici coronali siano visibili per l'ispezione diretta degli occhi e la fotografia digitale (Figura 3a). Utilizzare superfici di taglio con griglie millimetriche stampate su entrambi i lati per localizzare le strutture cerebrali, le dimensioni e le possibili anomalie in modo più accurato.
- Scatta tutte le foto digitali necessarie in ogni caso particolare per documentare possibili macro-anomalie e per tenere conto di eventuali considerazioni clinico-neuroanatomiche e post-taglio. Chiedi a un assistente di ricerca di scattare fotografie digitali perpendicolarmente al cervello per catturare l'intera superficie corticale. Prendi appunti (possibilmente utilizzando un dispositivo di registrazione audio) di qualsiasi aspetto insolito del cervello rispetto a un cervello normale.
- Usando un bisturi affilato, seziona manualmente blocchi rettangolari più piccoli di tessuto cerebrale per ogni regione cerebrale stabilita. Seguire lo schema di raccolta della regione cerebrale proposto descritto nella Tabella 1.
- Inserire ogni blocco di tessuto in istocassette etichettate separatamente.
nota: Ogni blocco di tessuto cerebrale deve essere tagliato per adattarsi, per quanto possibile, al volume massimo standard dell'istocassetta (30 x 20 x 4 mm3).
- Etichettare le istocassette utilizzando un codice di de-identificazione per ogni caso e utilizzando identificatori neuroanatomici specifici (non utilizzare lettere o numeri casuali per cervelli diversi; piuttosto, utilizzare sempre gli stessi nomi anatomici regionali o numeri corrispondenti, come mostrato nella Tabella 1). Creare codici de-identificanti, ad esempio, generando numeri casuali o semi-casuali per ogni caso (ad esempio, BRC 130, dove 5B sta per Cervello, R sta per Risorsa, C sta per Centro e 130 è un'adesione progressiva o AD160001, dove AD sta per "Alzheimer's disease study", 16 è l'anno in cui è stata eseguita l'autopsia (2016), e 0001 un numero di esemplare di adesione progressivo).
nota: Questo passaggio è molto utile per i futuri ricercatori. Mantieni una legenda e specifica l'emisfero (L = emisfero sinistro, R = emisfero destro). Utilizzare due colori diversi di istocassette, stabilendo un colore specifico per ogni emisfero.
- Scatta tutte le foto digitali necessarie in ogni caso particolare per documentare possibili macroanomalie e per tenere conto di eventuali considerazioni clinico-neuroanatomiche e post-taglio. Chiedi a un assistente di ricerca di scattare fotografie digitali perpendicolarmente al cervello per catturare l'intera superficie corticale. Prendi nota di qualsiasi caratteristica insolita del cervello rispetto a un cervello normale.
- Scatta foto digitali (quante ne sono necessarie o desiderate) dell'intero cervello tagliato e delle istocassette associate.
Tabella 1. Schema di taglio biemisferico. Questa tabella mostra la singola area anatomica da sezionare sia nell'emisfero sinistro che in quello destro di ciascun cervello. Il taglio simmetrico biemisferico può essere eseguito su cervelli freschi e fissi.
| Regione neuroanatomica | etichetta | Fisso sinistro | Destra Fisso | Lasciato congelato | Destro Congelato |
| Bulbo olfattivo | Ob | | | | |
| Corteccia frontale polare | Pfc | | | | |
| Giro frontale medio | Mfg | | | | |
| Giro orbito-frontale | OFG | | | | |
| Lobulo della corteccia parietale inferiore | Trasmissione PCLI | | | | |
| Corteccia temporale superiore | Stc | | | | |
| Corteccia temporale media | Mcc | | | | |
| Corteccia cingolata anteriore | Acc | | | | |
| Corteccia cingolata posteriore | Pcc | | | | |
| Giro pre-centrale (Mettere uno spillo prima del taglio) | PrCRG | | | | |
| Giro post-centrale (Metti uno spillo prima del taglio) | PoCRG | | | | |
| Circonvoluzione occipitale (comprese le aree di Broadmann 17 e 18) | Oc | | | | |
| amigdala | Amy | | | | |
| Gangli della base a livello della commessura anteriore con nucleo basale di Meynert | BGMY | | | | |
| Tallamo e sottotallamo | TH-STH | | | | |
| Corpi mammillari e ipotalamo | MAM+IPO | | | | |
| Nuclei basali di forbrane | Bf | | | | |
| Ippocampo anteriore | ah | | | | |
| Ippocampo posteriore (a livello laterale del corpo genicolato), compresa la corteccia entorinale e la corteccia temporale inferiore | PH+CE+ITC | | | | |
| Corteccia cerebella e nucleo dentato | CRBDe | | | | |
| Mesencefalo (compresa la Substantia nigra) | MESSN | | | | |
| Pons incluso il Locus coeruleus (LC) | Pons | | | | |
| Medula oblongata Medula compreso DMV | MObi | | | | |
| Medula spinale | MSpi | | | | |
| Tomaia del midollo spinale | Sc | | | | |
| Dura Madre | decimetro | | | | |
