Determinazione della capacità di ritenzione del calcio dei mitocondri isolati

Abstract

Fonte: Li, W., et. al. Test della capacità di ritenzione del Ca2+ mitocondriale e test di rigonfiamento mitocondriale innescato dal Ca2+. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video mostra la procedura per valutare la capacità di ritenzione del calcio nei mitocondri monitorando in tempo reale i cambiamenti nella fluorescenza quando i mitocondri assorbono il calcio. Questo test è utile per studiare la funzione mitocondriale e i processi correlati al calcio, tra cui l'apoptosi e le malattie neurodegenerative.

Protocollo

1. Determinazione della capacità di ritenzione ca²⁺ mitocondriale

1. Preparare il terreno KCl (125 mM di KCl (cloruro di potassio), 2 mM di K₂HPO₄ (fosfato dipotassico), 1 mM di MgCl₂ (cloruro di magnesio), 20 mM di HEPES (acido 2-[4-(2-idrossietil)piperazin-1-il]etansolfonico), 5 mM di glutammato, 5 mM di malato e 2 μM di rotenone, pH 7,4) e aggiungere il colorante fluorescente verde legante Ca²⁺ a una concentrazione finale di 0,5 μM prima dell'esperimento.
2. Trasferire 1 mL di mitocondri isolati (0,4 mg/mL) in terreno KCl contenente 0,5 μM di colorante fluorescente verde legante Ca²⁺ in ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti.
3. Incubare i mitocondri e il colorante fluorescente verde legante Ca²⁺ nella piastra a 6 pozzetti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce ambientale per 1 minuto. Aggiungere 4 μL di una soluzione di 20 mM di CaCl₂ (cloruro di calcio) (20 mM di CaCl₂, 127 mM di KCl, 1 mM di MgCl_2,, 20 mM di HEPES, 5 mM di glutammato, 5 mM di malato, pH 7,4) a ciascun pozzetto a 6 pozzetti utilizzando l'impostazione di dispensazione automatica per introdurre 200 nmol di Ca²⁺/mg di proteina mitocondriale.
4. Utilizzare uno spettrometro a fluorescenza per monitorare le variazioni di fluorescenza ogni 3 s per 2 minuti con una lunghezza d'onda di eccitazione di 506 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 531 nm. La piastra è dotata di agitazione a 600 giri/min per 3 s tra le letture controllate da software (Figura 1).
5. Aggiungere altri 4 μL di aliquote di 20 mM di soluzione CaCl₂ a ciascun pozzetto e monitorare le variazioni di fluorescenza ogni 3 s per 2 min. Ripetere questo passaggio fino a quando la fluorescenza non aumenta con il tempo.
   NOTA: I mitocondri sono sfidati con l'aggiunta di Ca²⁺ indicata dall'aumento della fluorescenza di registrazione. Quando l'mPTP (poro di transizione della permeabilità mitocondriale) si apre, la fluorescenza aumenta con il tempo.
6. Interpretare la quantità totale di Ca²⁺ aggiunta fino all'apertura dell'mPTP come la capacità di ritenzione Ca²⁺.

Risultati

Figura 1: Le impostazioni del software per il test della capacità di ritenzione Ca²⁺.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Verde di calcio-5N	Tecnologie per la vita	C-3737	Colorante fluorescente verde legante il calcio
Glutammato	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
Malato	Sigma-Aldrich	46940-U
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Cloruro di magnesio	Sigma-Aldrich	457
Fosfato dipotassico	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
Cloruro di calcio	Sigma-Aldrich	V900266