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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione dei sistemi di infusione con pompa microosmotica
NOTA: Preparare la pompa, il tampone del liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) e il farmaco (soluzione proteica Met-CCL5/RANTES (10 ng/mL in aCSF)) in condizioni sterili utilizzando tamponi filtrati con filtri da 0,2 μm e condurre tutte le procedure sotto la cappa di coltura con i guanti. Le procedure chirurgiche vengono condotte come segue:
- Preparare le pompe microosmotiche un giorno prima dell'intervento: Riempire la pompa microosmotica cerebrale con liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) con una siringa da 1 ml e un ago a testa smussata forniti insieme al kit. Immergere la pompa microosmotica in aCSF e posizionarla su uno shaker agitando delicatamente per una notte.
ATTENZIONE: La pompa deve essere riempita con aCSF e devono essere evitate bolle d'aria all'interno della pompa (Figura 1A).
- Prima di iniziare l'intervento chirurgico, preparare la soluzione proteica ricombinante Met-CCL5/RANTES (10 ng/mL, diluita in aCSF) per l'esperimento. Rimuovere l'aCSF dalla pompa e riempire lentamente la pompa con la soluzione farmacologica fino a quando l'eccesso non fuoriesce.
NOTA: 15 mL di soluzione aCSF o Met-CCL5/RANTES sono sufficienti per 5-8 pompe.
ATTENZIONE: Ripetere la procedura per assicurarsi che la pompa sia completamente riempita con il farmaco senza bolle all'interno.
- Tagliare i tubi del catetere alla lunghezza desiderata e collegarli all'ago per infusione cerebrale smussato del kit di infusione cerebrale. Riempire il kit per infusione e i tubi con il farmaco.
- Infine, assemblare e collegare il kit per l'infusione cerebrale alla pompa microosmotica.
ATTENZIONE: Non devono formarsi bolle nel tubo o nella pompa (Figura 1A).
- Immergere l'intero set di fusione pompa-cervello osmotico in aCSF in una provetta sterilizzata da 50 ml per evitare che la pompa si secchi. Il set di fusione pompa-cervello osmotico è ora pronto per essere utilizzato per la chirurgia.
NOTA: I sistemi di pompe microosmotiche possono essere utilizzati per l'infusione di farmaci a lungo termine. Ciò garantisce una modalità sicura e conveniente di somministrazione del farmaco nel cervello del topo.
2. Chirurgia Ventricolare Intracerebrale – impianto della pompa micro-osmotica
ATTENZIONE: Sterilizzare l'ambiente chirurgico con etanolo al 75% e assicurarsi che le persone coinvolte nello studio indossino guanti sterili e un camice da laboratorio pulito. Gli strumenti/strumenti chirurgici devono essere sterilizzati in autoclave e asciugati prima dell'uso e successivamente sterilizzati con etanolo al 75% tra gli interventi chirurgici sui topi.
- Pesare il topo e anestetizzarlo utilizzando l'iniezione intraperitoneale (IP) con Ketamina/Xilazina (Ketamina 50 mg/kg, Xilazina 10 mg/kg).
ATTENZIONE: I topi con peso corporeo inferiore a 24 g non sono raccomandati per la chirurgia di impianto della pompa osmotica.
- Montare e fissare la testa del topo sull'apparato stereotassico (Figura 1B).
- Usa un paio di forbici chirurgiche e tenaglie per aprire la pelle esterna che copre il cranio. Usa lo iodio per pulire il cranio periferico.
- Separare lo strato più esterno della pelle dalla pelle sottocutanea con l'aiuto di un paio di pinze a testa smussata vicino alla regione del collo per l'impianto del set di fusione pompa-cervello osmotico (Figura 1C).
- Contrassegnare il punto di infusione con riferimento alla mappa cerebrale (Figura 1D) utilizzando l'apparato stereotassico. In questo esperimento, l'ago deve essere impiantato nella regione del 3° ventricolo (Bregma: 0,0 mm laterale, 1,3 mm posteriore, 5,7 mm ventrale).
- Praticare un foro utilizzando un trapano per chiodi attorno all'area contrassegnata sul cranio (Figura 1E).
ATTENZIONE: Fare attenzione a non rompere le meningi e i vasi sanguigni del topo, evitando così l'interruzione dei micro-vasi sanguigni nel cervello.
- Posizionare il set di fusione pompa-cervello microosmotico contenente aCSF (come controllo) o farmaco (soluzione proteica Met-CCL5/RANTES) sotto la pelle dietro la regione del collo e inserire l'ago per infusione cerebrale nel foro praticato per infondere il farmaco nel cervello del topo (Figura 1E). L'ago penetrerà nelle meningi ed entrerà nel ventricolo. Fissare l'ago in posizione sul cranio utilizzando un gel desensibilizzante superficiale (Figura 1F) e attendere 1-2 minuti fino a quando la colla non si asciuga. Quindi, tagliare la parte sporgente sopra l'ago (Figura 1G-H).
- Utilizzare una colla adesiva per tessuti per guarire la ferita dell'operazione sulla testa. Applicare 50 μl di colla sulla parte superiore della ferita, unire entrambi i lati della pelle e tenere premuto per 30 s per consentire alla pelle di sigillarsi (Figura 1I).
ATTENZIONE: Utilizzare un tampone alcolico al 100% per pulire la ferita dopo l'intervento chirurgico e 100 ul di penicillina con streptomicina per prevenire l'infezione. nota: La pelle del topo formerà tessuto cicatriziale e guarirà in pochi giorni dopo la somministrazione della colla chirurgica. Il vantaggio principale della colla è l'evitare punti chirurgici, che possono causare irritazioni o infiammazioni della pelle.
- Mettere il topo in una gabbia pulita tenuta su una piastra calda (riscaldata fino a 37 °C) e attendere che il topo si riprenda dall'effetto anestetico.
ATTENZIONE: È fondamentale mantenere la temperatura corporea del topo per aumentare le possibilità di sopravvivenza dopo l'intervento chirurgico.
- Dopo un periodo di recupero di una settimana, i topi saranno pronti per ulteriori esperimenti, come il test di tolleranza al glucosio orale (OGTT) e il test di tolleranza all'insulina (ITT).
3. Test di tolleranza al glucosio orale (OGTT)
NOTA: Eseguire il test di tolleranza al glucosio orale 7 giorni dopo l'infusione di aCSF e MetCCL5/RANTES (10 ng/mL, 100 μL). Mantenere un digiuno di 6 ore per i topi prima dell'OGTT con sufficiente apporto idrico. Tenere gli animali sullo stesso banco di lavoro in cui verranno eseguiti gli esperimenti in modo che possano acclimatarsi all'ambiente per ridurre lo stress durante la procedura.
- Preparazione della soluzione di glucosio: Prima di condurre l'esperimento, preparare la soluzione di glucosio sciogliendo 3,75 g di glucosio in 15 ml di H2O distillato.
- Stabilire un calendario per la registrazione delle letture durante la procedura sperimentale (Tabella 1).
NOTA: È importante stabilire un calendario con intervalli adeguati tra ogni esame del sangue per consentire una registrazione accurata durante l'esperimento.
- Pesare ogni topo dopo il digiuno e calcolare la quantità appropriata di glucosio da iniettare. Ad esempio, se il topo pesa 30 g, la quantità di soluzione di glucosio da somministrare deve essere di 300 μl.
- Preparare i seguenti strumenti al banco di lavoro:
- Glucometro (premere il pulsante di avvio per controllare lo stato della batteria; assicurarsi che funzioni prima del test.)
- Chip di glucosio
- Siringa da insulina (siringa da insulina da 0,3 ml)
- Lamette
- temporizzatore
- Una volta allestito il banco, misurare e registrare il livello di glucosio nel sangue come segue: Inserire un chip di glucosio pulito e nuovo nel glucometro e premere il pulsante di avvio per azzerarlo.
- Prendi il topo per la parte posteriore del collo e accarezza la coda un paio di volte per garantire un flusso sanguigno sufficiente nella regione della coda.
- Usando una nuova lama di rasoio per tagliare un piccolo pezzo di coda e spremere una piccola goccia di sangue (circa 10-20 μL) nel chip di glucosio. Il sangue dovrebbe riempire il chip per consentire una misurazione accurata. Il glucometro visualizzerà immediatamente il livello di glucosio. Se la macchina mostra un "errore", ripetere la procedura con un nuovo chip di glucosio.
NOTA: Il chip di glucosio richiede solo una goccia di sangue. Quando il campione di sangue deve essere raccolto più di una volta, è sufficiente applicare una pressione facendo scorrere più volte le dita lungo la coda del topo tenendo l'estremità della coda direttamente sopra il chip per raccogliere il sangue. Non è necessario tagliare la coda ogni volta durante la raccolta di campioni di sangue.
- Successivamente, somministrare ai topi glucosio (0,25 g/mL) per via orale utilizzando la tecnica della sonda gastrica. La quantità di glucosio da somministrare deve essere calcolata utilizzando la formula: 10X il peso corporeo (BW) μL di soluzione di glucosio (ad esempio, se il topo pesa 30 g, la quantità di soluzione di glucosio da somministrare sarà di 300 μL). Avviare il timer immediatamente dopo la somministrazione di glucosio per via orale.
- Ripetere la procedura di misurazione del glucosio a 15, 30, 60, 90 e 120 minuti.
- Dopo che tutte le letture del livello di glucosio sono state registrate, gettare le lame di rasoio e le chips di glucosio in un contenitore a rischio biologico. Rimetti il cibo nelle gabbie dei topi e rimettili nella stanza degli animali.
Tabella 1. Calendario per la registrazione del test orale di tolleranza al glucosio (OGTT)
| # | ID mouse | corpo | glucosio | inizio | 0 | 15 | 30 | 60 | 90 |
| | peso | μL =10xBW | Ore | Minuti | Minuti | Minuti | Minuti | Minuti |
| 1 | 501 | 25,8 g | 258 | Ore 9:00 | Ore 9:00 | Ore 9:00 | 9:15 | Ore 9:30 | Ore 10:00 |
| numero arabo | Codice: 502 | 25,3 g | 253 | 9:07 | 9:07 | 9:07 | 9:22 | 9:37 | 10:07 |
