Induzione sperimentale del glaucoma tramite ostruzione dell'angolo iridocorneale in un modello murino

Abstract

Fonte: Bunker, S., et al. Glaucoma sperimentale indotto dall'iniezione oculare di microsfere magnetiche. J. Vis. Exp. (2015)

In questo video, un ratto anestetizzato viene sottoposto a una procedura oculare in cui le perle magnetiche vengono iniettate nella camera anteriore sotto un campo magnetico per bloccare l'angolo iridocorneale. Questo blocco ostruisce la rete trabecolare, impedendo il drenaggio dell'umore acqueo e portando ad un aumento della pressione intraoculare, danneggiando le cellule gangliari retiniche e il nervo ottico. Questo sviluppa una condizione simile al glaucoma.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Induzione dell'ipertensione oculare

1. Indurre il glaucoma sperimentale aumentando la pressione intraoculare (IOP) tramite iniezione unilaterale di microsfere paramagnetiche nella camera anteriore dei ratti Norvegia Bruna. Altri ratti pigmentati possono essere adatti, anche se l'utente dovrebbe prima convalidarli.
2. Allestire 250-300 g di ratti bruni norvegesi femmina ex-riproduttori in un ambiente costantemente con scarsa illuminazione (40-60 lux) per ridurre al minimo le fluttuazioni diurne della IOP, con accesso a cibo e acqua.
3. Effettuare le misurazioni della IOP di base negli animali svegli8 prima dell'anestesia e dell'iniezione di microsfere, utilizzando un tonometro a rimbalzo calibrato per l'uso nell'occhio del ratto9. La IOP è considerata la media di cinque letture.
4. Anestetizzare i ratti con 37,5 mg/kg di ketamina e 0,25 mg/kg di medetomidina cloridrato somministrati per via intraperitoneale. Confermare la profondità dell'anestesia testando i riflessi del piede posteriore dell'animale prima dell'applicazione di iodio povidone (vedere passaggio 1.5) e dell'iniezione di perline (vedere passaggio 1.8). Somministrare proparacaina cloridrato allo 0,5% per analgesia.
   NOTA: Non dilatare la pupilla in nessuna fase. Questo aiuterà le perle a stabilirsi meglio nell'angolo iridocorneale e a prevenire il legame con la lente. Applicare un unguento oculare per prevenire l'essiccazione corneale sull'occhio controlaterale non operato.
5. Lavare l'occhio operatorio con iodio povidone al 5% in acqua 5 minuti prima dell'iniezione.
6. Dopo 5 minuti, rimuovere lo iodio povidone con una garza sterile e lavare l'occhio con una soluzione salina sterile allo 0,9%. Mantenere l'occhio umido durante l'anestesia con l'applicazione regolare di soluzione fisiologica sterile.
7. Posizionare un magnete toroidale intorno all'occhio.
8. Iniettare 25 μl di una soluzione contenente 30 mg/ml di microsfere magnetiche da 8 μm sterilizzate con irradiazione gamma nella soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) nella camera anteriore utilizzando un ago smussato da 33 G.
   1. Per preparare le perle, lavare rimettendo in sospensione, quindi centrifugare 3 volte a 10.000 x g per 5 minuti con 1 ml di HBSS prima di preparare la soluzione finale di 30 mg/ml. Mantenere le condizioni di sterilità per tutto il tempo.
   2. Per l'iniezione, fare attenzione a evitare di inserire l'ago nell'iride, per ridurre al minimo il rischio di trauma dell'iride. Questo può essere evitato orientando l'ago tangenzialmente alla superficie corneale, il più parallelo possibile all'iride. Ciò contribuirà anche a ridurre al minimo la perdita di perline dal sito di iniezione.
      NOTA: Iniettare le perle a una velocità elevata per garantire una distribuzione uniforme attorno all'angolo iridocorneale, che è fondamentale per aumentare la IOP. Inoltre, conservare separatamente le perline, gli aghi e gli anelli magnetici in modo che le perline non formino grappoli, rendendoli difficili da caricare nella siringa e iniettare, e l'ago non si magnetizzi.
9. Lasciare l'ago in posizione per 1 minuto dopo l'iniezione per assicurarsi che le perle si depositino nell'angolo iridocorneale per impedire il drenaggio acquoso dalla rete trabecolare. Inclinare leggermente l'ago dopo che le perle si sono inizialmente depositate per consentire una certa fuoriuscita di acqua, per ridurre al minimo gli aumenti transitori della IOP. Al termine dell'intervento, sciacquare l'ago con prima soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), quindi etanolo al 70%, seguito da acqua distillata, per garantire l'uso continuo dell'ago in procedure separate. In alternativa, si possono utilizzare aghi usa e getta se è disponibile la corretta combinazione di calibro e siringa. Opzionale: gli aghi possono essere affilati utilizzando una smussatrice per prolungarne l'uso.
10. A questo punto, se necessario, rimuovere il magnete e utilizzarlo per disegnare le perline nelle aree di copertura incompleta.
11. Lasciare il magnete in posizione intorno all'occhio per altri 10 minuti dopo l'iniezione per assicurarsi che le perle si depositino bene nell'angolo iridocorneale.
12. Anestesia inversa utilizzando 0,25 mg/kg di atipemezolo cloridrato.
13. Somministrare cloramfenicolo o altri unguenti antibiotici, ad esempio gentamicina o terramicina per via topica per prevenire l'infezione e proparacaina cloridrato allo 0,5% per l'analgesia. Lascia che gli animali si riprendano su un tappetino termico fino a quando non riacquistano il movimento, quindi trasferiscili in una scatola calda e fornisci loro ulteriore nutrimento, come un integratore alimentare o una dieta regolare inumidita, fino al completamento del recupero. L'analgesia sistemica o locale deve essere somministrata agli animali che mostrano segni di dolore 24 ore dopo l'intervento chirurgico. Se questi sintomi persistono nonostante il trattamento, gli animali devono essere abbattuti in modo umano.
14. Utilizzare l'occhio controlaterale come controllo non operato.
15. Effettuare misurazioni della IOP ogni 2-3 giorni dopo la somministrazione del cordone e successivamente ogni 2-3 giorni utilizzando un tonometro a rimbalzo calibrato per l'uso nell'occhio del ratto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
250-300g femmine di ratti bruni norvegesi ex-riproduttori	Harlan, Regno Unito	203
Tonometro a rimbalzo Tonolab	Tiolat	TV02
Ketaset (Ketamina)	Fort Dodge Salute degli animali	BN1000118	37,5 mg/kg
Domitore (medetomidina cloridrato)	Orion Pharma	140-999	0,25 mg/kg
Iodio povidone	Ecolab	BN4369LE10	5% in H2O
Soluzione salina di Minim	Bausch e Lomb	PL00033/5017
Magnete toroidale	Supermagnete	R-10-07-03-N
Microsfere magnetiche	Laboratori Bangs	UMC4N/9692
HBSS	Invitrogen	14025
Ago smussato calibro 33	Hamilton	7747-01	Ago personalizzato
Siringa con punta Luer	Hamilton	80601
Antisedan (atipemezolo cloridrato)	Orion Pharma	141-003	0,25 mg/kg
Unguento al cloramfenicolo	Medicom	18956-0005