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Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali competente.
1. Preparazione dei vetrini e dei tessuti
- Utilizzare vetrini per la preparazione del silano o vetrini in vetro con membrana in polietilene naftalato (PEN).
- Per l'isolamento dell'RNA, immergere i vetrini nella soluzione di decontaminazione con RNasi, lavare 3 volte con acqua priva di RNasi, quindi disidratare con una serie graduata di etanolo privo di RNasi e asciugare sottovuoto per 30 minuti.
- Tagliare sezioni di tessuto a 10 μm di spessore utilizzando un criostato e montarle sui vetrini privi di RNasi preparati. Mantenere le sezioni congelate durante il sezionamento per preservare la qualità dell'RNA. nota: Assicurarsi che il tessuto si trovi a circa 4 mm di distanza dai bordi del vetrino, poiché l'LCM non è in grado di rimuovere il tessuto troppo vicino ai bordi del vetrino. Per rimuovere il tessuto da un vetrino a membrana PEN, assicurarsi che il tessuto sia a 4 mm da sinistra, in alto e in basso e a 7 mm dal lato destro del vetrino, che sono le dimensioni della membrana che non è attaccata al vetrino.
- Per l'isolamento di singole popolazioni cellulari mediante immunoistochimica diretta, sezionare il tessuto sui vetrini di preparazione del silano o sui vetrini di membrana PEN. Per l'isolamento di regioni di tessuto utilizzando tecniche guidate dall'immunoistochimica indiretta, montare una serie di sezioni su un vetrino di preparazione del silano per l'immunoistochimica e alternare le sezioni su un vetrino a membrana PEN e/o un vetrino di preparazione del silano da utilizzare per la LCM.
2. Preparazione del tessuto per la cattura laser - Immunoistochimica rapida della tirosina idrossilasi per la cattura laser diretta di cellule immunoreattive
- Delineare il tessuto con una penna idrofobica e lasciarlo asciugare.
- Fissare il tessuto in una soluzione di acetone-metanolo (1:1) a -20 °C per 10 minuti. NOTA: La nostra esperienza ha dimostrato che la fissazione acetone-metanolo ha portato a un'immunoistochimica molto più costante rispetto all'acetone o al metanolo da soli.
- Risciacquare il vetrino in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con Triton all'1% (privo di RNasi).
- Coprire le sezioni con 100-200 μl di PBS con Triton all'1% con anticorpo tirosina idrossilasi diluito 1:100 con 400 U/ml di RNasin. Incubare per 5-10 minuti.
- Sciacquare brevemente con PBS due volte e PBS-1% Triton.
- Coprire il tessuto con 100-200 μl di IgG anti-coniglio di capra marcato con Alexa Fluor 488 diluito 1:100 in PBS-1% Triton con 400 U/ml di RNasina e 50 ng/ml di DAPI. Incubare per 5 min.
- Risciacquare 2 volte in PBS, quindi disidratare 30 s in una serie graduata di etanolo libero da RNasi (75%-75%-95%-95%-100%-100%).
- Incubare in due lavaggi di xilene per 1 minuto e poi 5 minuti.
- Rimuovere i vetrini dallo xilene immediatamente prima dell'uso per LCM e lasciarli asciugare all'aria.