Immunoistochimica di sezioni di tessuto cerebrale di topo per il targeting dei neuroni della dopamina

Abstract

Fonte: Kummari, E., et. al., Microdissezione a cattura laser - Una dimostrazione dell'isolamento dei singoli neuroni dopaminergici e dell'intera area tegmentale ventrale., J. Vis. Exp. (2015)

In questo video, dimostriamo il protocollo di immunoistochimica per i neuroni dopaminergici in sezioni di tessuto cerebrale per la successiva microdissezione a cattura laser.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali competente.

1. Preparazione dei vetrini e dei tessuti

1. Utilizzare vetrini per la preparazione del silano o vetrini in vetro con membrana in polietilene naftalato (PEN).
2. Per l'isolamento dell'RNA, immergere i vetrini nella soluzione di decontaminazione con RNasi, lavare 3 volte con acqua priva di RNasi, quindi disidratare con una serie graduata di etanolo privo di RNasi e asciugare sottovuoto per 30 minuti.
3. Tagliare sezioni di tessuto a 10 μm di spessore utilizzando un criostato e montarle sui vetrini privi di RNasi preparati. Mantenere le sezioni congelate durante il sezionamento per preservare la qualità dell'RNA. nota: Assicurarsi che il tessuto si trovi a circa 4 mm di distanza dai bordi del vetrino, poiché l'LCM non è in grado di rimuovere il tessuto troppo vicino ai bordi del vetrino. Per rimuovere il tessuto da un vetrino a membrana PEN, assicurarsi che il tessuto sia a 4 mm da sinistra, in alto e in basso e a 7 mm dal lato destro del vetrino, che sono le dimensioni della membrana che non è attaccata al vetrino.
4. Per l'isolamento di singole popolazioni cellulari mediante immunoistochimica diretta, sezionare il tessuto sui vetrini di preparazione del silano o sui vetrini di membrana PEN. Per l'isolamento di regioni di tessuto utilizzando tecniche guidate dall'immunoistochimica indiretta, montare una serie di sezioni su un vetrino di preparazione del silano per l'immunoistochimica e alternare le sezioni su un vetrino a membrana PEN e/o un vetrino di preparazione del silano da utilizzare per la LCM.

2. Preparazione del tessuto per la cattura laser - Immunoistochimica rapida della tirosina idrossilasi per la cattura laser diretta di cellule immunoreattive

1. Delineare il tessuto con una penna idrofobica e lasciarlo asciugare.
2. Fissare il tessuto in una soluzione di acetone-metanolo (1:1) a -20 °C per 10 minuti. NOTA: La nostra esperienza ha dimostrato che la fissazione acetone-metanolo ha portato a un'immunoistochimica molto più costante rispetto all'acetone o al metanolo da soli.
3. Risciacquare il vetrino in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con Triton all'1% (privo di RNasi).
4. Coprire le sezioni con 100-200 μl di PBS con Triton all'1% con anticorpo tirosina idrossilasi diluito 1:100 con 400 U/ml di RNasin. Incubare per 5-10 minuti.
5. Sciacquare brevemente con PBS due volte e PBS-1% Triton.
6. Coprire il tessuto con 100-200 μl di IgG anti-coniglio di capra marcato con Alexa Fluor 488 diluito 1:100 in PBS-1% Triton con 400 U/ml di RNasina e 50 ng/ml di DAPI. Incubare per 5 min.
7. Risciacquare 2 volte in PBS, quindi disidratare 30 s in una serie graduata di etanolo libero da RNasi (75%-75%-95%-95%-100%-100%).
8. Incubare in due lavaggi di xilene per 1 minuto e poi 5 minuti.
9. Rimuovere i vetrini dallo xilene immediatamente prima dell'uso per LCM e lasciarli asciugare all'aria.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Silani prep-slides	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S4651
95% esente da etanolo-RNasi	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	E7148
100% esente da etanolo-RNasi	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	E7023
Rnase Free Triton	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T8787
Anticorpo anti-tirosina idrossiasi	EDM Millipore, Billerica, MA	Ab152
Alexa Fluor 488 capra anti-coniglio IgG	Life Technologies, Grand Island, NY	A-11008
RNaseZap	Life Technologies, Grand Island, NY	AM9780