Studio del traffico proteico di membrana nelle cellule fotorecettrici di Drosophila

Abstract

Fonte: Wagner, K. et al., Studio del traffico proteico di membrana nelle cellule fotorecettrici di Drosophila utilizzando proteine marcate con eGFP. J. Vis. Exp. (2022).

Questo video mostra la visualizzazione del traffico proteico di membrana nelle cellule fotorecettrici di Drosophila utilizzando proteine TRPL marcate con eGFP. Descrive in dettaglio la preparazione di mosche transgeniche per l'imaging, l'acquisizione di immagini a fluorescenza di cellule fotorecettrici e la quantificazione del traffico di TRPL misurando la fluorescenza relativa di eGFP nei rabdomeri.

Protocollo

1. Considerazioni generali

1. Usa le scorte di Drosophila che esprimono una traslocazione permanentemente localizzata rabdomeralmente per analisi riguardanti il traffico proteico (ad esempio, canale ionico TRPL (Transient Receptor Potential-like):: enhanced green fluorescent protein (eGFP), Arrestina 2 ( Arr2)::eGFP).
2. Predetermina le condizioni di esposizione alla luce delle mosche selezionate per l'approccio sperimentale.
   1. Per l'adattamento al buio, tieni le mosche in scatole scure per il periodo desiderato a 25 °C. Per un'illuminazione fino a 16 ore in esperimenti di traslocazione (ad esempio, mosche che esprimono TRPL::eGFP), tenere le mosche sotto un tubo fluorescente a temperatura ambiente.
   2. Per illuminare le mosche con luce colorata, usa scatole di plastica trasparente di diversi colori insieme al tubo fluorescente.

2. Microscopia

1. ad immersione in acquaPreparazione della mosca
   1. Prepara lo spazio di lavoro con l'attrezzatura e i reagenti necessari, come mostrato nella Figura 1. Trasferire le mosche con età e condizioni di illuminazione predeterminate in una provetta da centrifuga da 15 ml pre-raffreddata e anestetizzarle incubandole su ghiaccio per 15-30 minuti.
      NOTA: Porta con te mosche di 1 giorno, adattate al buio come riferimento. In generale, le mosche adattate al buio dovrebbero essere trasferite in una ghiacciaia con un coperchio al buio. Le mosche adattate alla luce possono essere trasferite al ghiaccio nella luce della stanza.
   2. Trasferisci una mosca anestetizzata con ghiaccio a testa in giù in un puntale per pipetta da 200 μL e spingi la mosca verso il puntale con cautela con aria compressa.
   3. Taglia la punta della pipetta proprio davanti alla testa usando un bisturi. Usando una pinzetta, spingi con cautela la mosca a pochi millimetri di distanza dalla punta. Tagliare nuovamente il puntale della pipetta e spingere la patta verso il puntale con aria compressa in modo che solo la testa della mosca sporga dal puntale della pipetta.
   4. Fai aderire un pezzo di plastilina su un vetrino per oggetti e premi la punta della pipetta in modo che l'occhio sinistro o destro della mosca sia rivolto verso l'alto (Figura 2A). Subito prima dell'acquisizione dell'immagine, utilizzare una pipetta da laboratorio per far aderire una grossa goccia di acqua refrigerata alla parte inferiore di un obiettivo a immersione in acqua (Figura 2B). Procedere immediatamente all'acquisizione dell'immagine per ottenere i migliori risultati.
      NOTA: Un ritardo significativo nell'acquisizione dell'immagine provoca il risveglio e i movimenti della mosca che possono portare a immagini sfocate.
      
2. Image acquisition
   1. Posiziona con cura il vetrino dell'oggetto con la mosca preparata sul tavolino del microscopio e seleziona un obiettivo per immersione in acqua.
   2. Abbassa manualmente l'obiettivo di immersione in acqua fino a quando l'occhio della mosca tocca la goccia (Figura 3A, B).
   3. Accendi la lampada UV del microscopio e seleziona il set di filtri appropriato. Utilizzare gli oculari per posizionare la mosca sotto l'obiettivo e mettere a fuoco il microscopio sulla superficie dell'occhio.
   4. Cambia il percorso della luce verso la fotocamera del microscopio e genera un'immagine dal vivo nel software corrispondente. Regolare nuovamente la messa a fuoco della fotocamera e valutare l'orientamento dell'occhio, considerando che l'occhio deve essere rivolto radialmente verso l'obiettivo del microscopio, come illustrato più dettagliatamente nella Figura 3C-E.
   5. Usa la LUT appropriata (cerca tabella) all'interno del software di imaging per rilevare la sovrasaturazione (indicata come pixel rossi).
   6. Nel caso di mosche non pigmentate, regola il tempo di esposizione in modo che i pixel più luminosi siano appena al di sotto del limite di saturazione per ogni immagine.
   7. Registra un'immagine e salvala come file raw per archiviare tutti i metadati corrispondenti della registrazione. Esportare l'immagine in un formato .tif per la quantificazione successiva.
      NOTA: Illumina le mosche per 5 minuti con luce rossa (ad esempio, 630 nm) subito dopo l'acquisizione dell'immagine, se sono destinate ad essere utilizzate per ulteriori esperimenti. La luce rossa disattiva la cascata di fototrasduzione che è stata attivata eccessivamente dalla luce intensa a onde corte durante l'acquisizione dell'immagine.
      
3. Analisi dei dati e quantificazione della fluorescenza relativa di eGFP nei rabdomeri delle micrografie ad immersione in acqua
   1. Scarica, installa ed esegui il software ImageJ/Fiji.
   2. Regola le impostazioni di ImageJ cliccando su >Analizza > Imposta Misure... e selezionare solo la casella Valore medio di grigio. Importa un'immagine .tif cliccando su File > Apri... o trascinando e rilasciando. Scegli una regione rappresentativa dell'immagine a fuoco e ingrandiscila al 200%-300% premendo ripetutamente Ctrl e + insieme.
   3. Seleziona lo strumento Ovale e, mentre premi il tasto Maiusc, genera una selezione circolare nell'immagine che è significativamente più piccola di un rabdomero fluorescente. Prima di rilasciare il pulsante del mouse, cercate le dimensioni esatte visualizzate sotto la barra degli strumenti nella finestra principale di ImageJ. Utilizzare la stessa dimensione di selezione circolare per tutte le analisi.
      NOTA: La dimensione esatta della selezione circolare in pixel o micron dipende dalla configurazione specifica. Utilizzare un cerchio di circa 1/3 o 1/4 del diametro rabdomerale delle mosche di controllo di 1 giorno, adattate al buio.
   4. Sposta la selezione circolare facendo clic con il mouse su di essa e trascinandola o premendo i tasti freccia sulla tastiera.
   5. Per misurare le intensità di fluorescenza all'interno della selezione circolare, sposta il cerchio sul primo rabdomero (r1) e fai clic su >Analizza > misura o usa la scorciatoia Ctrl + M. Verrà visualizzata una finestra dei risultati che elenca il valore di grigio misurato.
   6. Continua con le misurazioni di r2-r6 come misurazioni ripetute e una misurazione del segnale di fondo (b). Nel caso di mosche non pigmentate, effettuare ulteriori misurazioni delle corrispondenti aree del corpo cellulare (c1-c6) (Figura 4).
   7. Ripeti i passaggi 2.3.5 e 2.3.6 per altri due ommatidi, risultando in tre repliche tecniche. Contrassegnare gli ommatidi analizzati utilizzando lo strumento Matita e salvare questa immagine per la documentazione.
   8. Seleziona e copia i valori di grigio misurati dalla finestra dei risultati e incollali nel software del foglio di calcolo per ulteriori calcoli. Ordina i valori dell'intensità della fluorescenza in base alla loro origine nelle categorie rabdomero (r), corpo cellulare (c) e sfondo (b). Calcola l'intensità media di ciascuna categoria (Ir, Ic, Ib).
   9. Calcola la quantità relativa di eGFP presente nel rabdome.
   10. Continua con l'immagine successiva nel passaggio 2.3.3. Si raccomanda di utilizzare le immagini di almeno cinque individui di ciascun gruppo sperimentale come repliche biologiche per ottenere una misurazione affidabile.

Risultati

Figura 1: Area di lavoro per microscopia ad immersione in acqua. I materiali necessari sono: (A) provetta da centrifuga da 15 ml, (B) scaglie di ghiaccio, (C) acqua distillata refrigerata, ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
15 mL provetta da centrifuga	Greiner Bio-One	188271
Carbon dioxide anestesia fly pad	Flystuff	59-172
Lampada a luce fredda (KL 1500 LCD)	Zeiss
Fiji/ImageJ	NIH
Microscopio a fluorescenza con lampada UV, fotocamera, set di filtri e software (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition)	Zeiss
Fluorescent tube	Osram	4050300518039.00<
Pipetta da laboratorio (20-200 μL)	Eppendorf
Oggetto slide	Roth	656.1
Puntali per pipette (200 μL)	Labsolute	7695844
Plastilina (Blu-Tack)	Bostik	30811745
Stereomicroscopio (SMZ445)	bordo-superiore:nessuno;'>
Stereomicroscopio con lampada UV, fotocamera, set di filer e software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12)	Leica

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