Rilevamento delle modificazioni istoniche nelle cellule di lievito con sovraespressione di proteine neurodegenerative

Abstract

Fonte: Bennett, S. A., et al., Caratterizzazione delle alterazioni delle modificazioni post-traduzionali degli istoni nei modelli di proteinopatia neurodegenerativa del lievito. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video mostra la procedura di valutazione delle modificazioni istoniche nelle cellule di lievito che sovraesprimono proteine neurodegenerative. Le fasi includono la lisi cellulare, la centrifugazione, l'elettroforesi, il trasferimento della membrana e la rilevazione basata su anticorpi degli istoni modificati.

Protocollo

1. Lisi cellulare e western blotting per rilevare modifiche

1. post-traduzionali istonicheCell lysis
   1. Scongela i pellet di cellule di lievito sul ghiaccio e risospendi i pellet cellulari in 100 μL di dH₂O.
   2. Alla risospensione cellulare, aggiungi 300 μL di NaOH 0,2 M e 20 μL di 2-mercaptoetanolo. Risospendere pipettando su e giù.
   3. Incuba le cellule sul ghiaccio per 10 minuti e poi centrifugate a 3.200 x g su una centrifuga da tavolo per 30 s a RT. Scarta il surnatante.
   4. Risospendere il pellet della cella in 100 μL di 1x colorante di caricamento e far bollire per 10 minuti su un blocco riscaldante.
      NOTA: La ricetta per caricare 6x il colorante può essere trovata nella Tabella dei Materiali.
2. Elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide e trasferimento di membrana
   Prepara la camera del gel mettendo due gel in un supporto per gel, riempiendo la camera interna fino all'alto con un tampone di scorrimento e riempiendo la camera esterna fino al segno della linea a due gel.
   1. Carica 15 μL di campione per pozzetto in un gel di poliacrilammide al 12% a 10 pozzetti. Per la corsia a scala delle proteine, caricare 5 μL.
   2. Esegui il gel per circa 45 minuti a 150 V, o fino a quando il fronte del colorante di caricamento raggiunge il fondo del gel.
   3. Mentre il gel è in funzione, preparati per il trasferimento della membrana immergendo i cuscinetti di fibra (due per gel) nel tampone di trasferimento (Tabella dei Materiali) e immergendo la membrana del fluoruro di polivinilidene (PVDF) nel metanolo. Sciacquare la membrana nel tampone di trasferimento prima del trasferimento.
      NOTA: La membrana in PVDF deve essere tagliata alla dimensione del gel e utilizzare una membrana in PVDF per ogni gel trasferito.
   4. Assembla, su una cella dell'apparato di trasferimento semi-asciutta, un 'sandwich' di trasferimento: dall'elettrodo inferiore, posiziona (1) un tampone in fibra preimbevuto, (2) membrana in PVDF preimbevuta e risciacquata, (3) gel e (4) un secondo tampone in fibra preimbevuto.
      NOTA: Per evitare bolle d'aria nel 'sandwich' di trasferimento, ' arrotolare delicatamente il 'sandwich' con una pipetta sierologica per far uscire le bolle. Una volta che il gel è stato posizionato sopra la membrana PDVF, non spostarla.
   5. Per effettuare il trasferimento delle proteine, imposta l'alimentatore a 150 mA per 1 ora (per un 'sandwich').
3. Rilevamento di modifiche post-traduzionali istoniche (PTM) con anticorpi specifici per la modifica
   1. Rimuovi la membrana dall'apparato di trasferimento. Sciacquare brevemente con dH₂O.
      1. Facoltativamente, controlla il trasferimento delle proteine con la colorazione Ponceau-S versando abbastanza colorante Ponceau-S da coprire la membrana in una piccola scatola di plastica e incubando a RT agitando delicatamente per 30-60 s. Rimuovi la macchia Ponceau-S e risciacqua con dH₂O fino a quando la macchia di fondo scompare e le bande proteiche sono visibili ad occhio nudo. Continuare a risciacquare con dH₂O fino a rimuovere tutte le macchie dalla membrana.
   2. Blocca la membrana incubando il blot per 1 ora a RT con un leggero dondolio in un tampone di blocco salino tamponato tris (TBS) (Tabella dei materiali) in una piccola scatola di colorazione. Utilizzare una quantità sufficiente di tampone bloccante per coprire la macchia.
      NOTA: Fai attenzione a posizionare la membrana in posizione verticale nella scatola di colorazione in modo che il lato della membrana su cui giacciono le proteine non sia rivolto verso il basso.
   3. Incuba il blot nella scatola di colorazione durante la notte con un anticorpo specifico per la modifica dell'istone reattivo verso il lievito a 4 °C. Diluisci l'anticorpo nel tampone bloccante TBS secondo le specifiche del produttore. Includere anche un adeguato controllo del carico nucleare, come l'H3 anti-totale sollevato in una specie ospite diversa dall'anticorpo specifico per la modifica. Ad esempio, se si esegue il sondaggio per H3S10ph con un anticorpo anti-H3S10ph sollevato nei conigli, utilizzare un anticorpo anti-H3 totale sollevato nei topi come controllo del carico. Ripetere l'operazione per ogni tamponamento, se necessario.
      NOTA: Le diluizioni degli anticorpi possono essere riutilizzate per un totale di tre volte in un mese. Conservarli a 4 °C.
   4. Lava la membrana 4 volte in TBS fatto in casa + 0,1% di polisorbato 20 (TBST) per 5 minuti con dondolo a RT.
   5. Incuba il blot con anticorpi secondari fluorescenti alle diluizioni specificate dal produttore (asino anti-coniglio 680 e asino anti-topo) per 1 ora a RT.
      NOTA: Gli anticorpi secondari fluorescenti devono essere protetti dalla luce sia durante la conservazione che durante l'uso. Effettuare l'incubazione in scatole di plastica scure o coprire con un foglio di alluminio.
   6. Lava la membrana 4 volte con TBST per 5 min e lava con TBS per 5 min mentre fai oscillazione a RT.
   7. Visualizza il blot su un sistema di imaging Western blot fluorescente per 2 min. Visualizza gli anticorpi secondari anti-coniglio 680 e anti-topo 800 rispettivamente nei canali 800 nm e 700 nm.
      NOTA: Le repliche vengono condotte in modo indipendente a partire dalla sezione 1. Per un'interpretazione appropriata dei dati in questi esperimenti, è necessario verificare che la risposta del segnale anticorpale rientri nell'intervallo in cui la risposta del segnale è lineare.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
10x Running Buffer			Miscelare: 141,65 g di glicina (ThermoFisher BP381-1), 30,3 g di base Tizma (Sigma-Aldrich T6066), 10 g di sodio dodecil solfato (Sigma-Aldrich L3771) e 1 L di acqua deionizzata, pH 8,8.
12% Gel di Poliacrilammide	BIO-RAD	456-1041	<
Sigma-Aldrich	M3148
Anti-acetil-istone H3 (Lys14) Primario Anticorpo	MilliporeSigma	07-353 (Lotto n. 2762291)	Diluizione: 1/1000
Anti-acetyl-Histone H4 (Lys16) Antibody primario	Abcam	ab109463 (Lotto No. GR187780)	Diluition: 1/2000
Anti-acetil-istone H4 (Lys12) Anticorpo primario	Abcam	ab46983 (Lotto No. GR71882)	Diluition: 1/5000
Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Antibody primario	Abcam	ab9049 (Lotto No. GR266894, GR3236147)<
Anticorpo primario H3 anti-istone	Abcam	ab24834 (Lotto n. GR236539, GR174196, GR3194335)	Controllo del carico nucleare; Diluizione: 1/2000
Anti-fosfo-istone H2B (Thr129) Anticorpo primario	Abcam	ab188292 (Lotto No. GR211874)	Diluition: 1/1000
Anti-fosfo-istone H3 (Ser10) Anticorpo primario	Abcam	ab5176 (Lotto No. GR264582, GR192662, GR3217296)	Diluizione: 1/1000
BioPhotometer D30	Eppendorf	6133000010
Centrifuga 5804/5804 R/5810/5810 R	Eppendorf	22625501
Asino Anti-Topo IRDye 800 CW	LI-COR	926-32212 (Lotto n. C60301-05, C61116-02, C80108-05)	Diluition: 1/5000
Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD	LI-COR	926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07)	Diluizione: 1/2500
Etanolo	Sigma-Aldrich	E7023
Carta macchiata extra spessa (carta da filtro)	BIO-RAD	1703968
Membrane di trasferimento Immobilon-FL	MilliporeSigma	IPFL00010
Loading Dye			Mix: 1.2 g di sodio dodecil solfato, 6 mg di blu di bromofenolo (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL di glicerolo, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Ditiotreitolo ( Sigma-Aldrich D0632) e 2,1 ml di acqua deionizzata.
Metanolo	ThermoFisher	A412-4
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell	BIO-RAD	1658004
Pipetta multicanale	Eppendorf	2231300045
Acqua libera da nucleasi	Qiagen	129114
Odyssey Fc Imaging System	LI-COR Biosciences	2800-03
pAG303GAL-a-sinucleina-GFP	Regalo da A. Gitler
pAG303GAL-ccdB	Addgene	14133
pAG303Gal-FUS<	29614
pAG303GAL-TDP-43	Regalo da A. Gitler
Poly(ethylene glycol) (PEG)	Sigma-Aldrich	P4338	Prepara una soluzione al 50% w/v.
Ponceau S Stain	Sigma-Aldrich	P3504	Mix: 0.5 g 0.1% p/p colorante Ponceau S, 5 mL 1% v/v acido acetico (Sigma-Aldrich 320099), e 500 mL di acqua deionizzata.
Alimentatore di base PowerPac	BIO-RAD	164-5050
Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer			Conservare a -20 oC. 6X, Miscelare: 1,2 g di sodio dodecil solfato, 6 mg di blu di bromofenolo, 0,93 g di DL-ditiotreitolo, 2,1 ml di acqua deionizzata, 4,7 ml di glicerolo e 1,2 ml di 0,5 ml di base Trizma, pH 6,8.
Idrossido di sodio	Sigma-Aldrich	221465	Prepara la soluzione 0.2 M.
TBS + 0.1% Tween 20 (TBST)			Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), e 900 mL di acqua deionizzata.
TBS Blocking Buffer	LI-COR	927-5000
Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophorretic Transfer Cell	BIO-RAD	170-3940
Transfer Buffer			Mix: 22,5 g di glicina, 4,84 g di base Tizma, 400 ml di metanolo, 1 g di sodio dodecil solfato e 1,6 L di acqua deionizzata.
Soluzione salina tamponata Tris (TBS)			10X, 7.6 pH, Soluzione: Mescolare 24 g di base Trizma e 88 g di cloruro di sodio (Sigma-Aldrich S7653). Riempire fino a 1 L con acqua deionizzata.
WT 303 S. cerevisiae lievito	Regalo da J. Shorter

td style='height:15.5pt;width:135pt;'>2-mercaptoethanoltd style='width:314pt;'>Diluition: 1/1000td style='width:108pt;'>Addgene