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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Soggetti
- Utilizzare ratti maschi di Sprague-Dawley (250-300 g all'arrivo).
- Ospita i ratti in gabbie a fondo solido in una stanza colonia con un'umidità del 40-60% e una temperatura ambiente (RT) di 21 ± 1 °C.
- Rendere disponibili acqua e cibo a libitum.
- Tenere i ratti sotto un ciclo buio/luce inverso di 12:12 ore (luci accese a 20 ore).
2. Chirurgia
- Per ratto, preparare due pezzi di legatura intestinale cromica (5-0) di circa 6 cm di lunghezza e metterli in soluzione salina sterile per evitare che si secchino e diventino rigidi e fragili.
- Anestetizzare l'animale con pentobarbital (60 mg/kg, intraperitoneale [i.p.]) e trattare con atropina (0,1 mg/kg, i.p.). Monitorare il livello di anestesia estendendo una gamba e pizzicando la rete di pelle tra le dita dei piedi con un'unghia per garantire l'applicazione di una pressione adeguata. Assicurarsi che l'animale non fletti l'arto. Se necessario, somministrare ulteriore pentobarbital.
- Radere la testa del ratto in modo che possa essere praticata un'incisione del cuoio capelluto sulla linea mediana di circa 25 mm con distanze uguali anteriormente e posteriormente al centro degli occhi.
- Fissa la testa del topo in una cornice stereotassica o fissa in altro modo la testa del topo. Posiziona il topo su un tappetino riscaldato per mantenere la temperatura corporea.
- Applicare un unguento oftalmico su entrambi gli occhi per evitare danni da secchezza.
- Strofinare la zona della testa rasata con alcol, quindi betadine.
- Praticare un'incisione del cuoio capelluto sulla linea mediana, esponendo il cranio e l'osso nasale.
- Utilizzare un microscopio operatorio per eseguire i passaggi da 2.9 a 2.16.
- Sezionare il bordo dell'orbita libera, formato dalle ossa mascellari, frontali, lacrimali e zigomatiche, utilizzando un tampone con punta di cotone e un paio di pinze Dumont. Utilizzare il tampone per assorbire il sangue da possibili emorragie.
- Per dare accesso al nervo infraorbitale (IoN), deviare delicatamente il contenuto orbitale con un batuffolo di cotone di precisione, facendo attenzione a non allungare eccessivamente il nervo etmoidale anteriore che attraversa superiormente l'IoN. Sezionare l'IoN liberandolo dal tessuto connettivo circostante, utilizzando un tampone di cotone di precisione e un paio di pinze Dumont con un movimento di diffusione. Utilizzare il tampone per assorbire il sangue da possibili emorragie.
- Per eseguire una legatura, spingere un'estremità di un singolo pezzo di intestino cromico verso il basso lungo l'osso frontale, medialmente all'IoN e avanzare di alcuni millimetri parallelamente e al di sotto dell'IoN. La legatura è ora tenuta in posizione tra l'IoN e l'osso frontale.
- Infilare la punta di una pinza Dumont angolata di 45 gradi sotto l'IoN per posizionarla in prossimità della legatura. Ritrarre delicatamente l'IoN lateralmente per rivelare la legatura e la punta della pinza. Afferrare la legatura con la pinza ed estrarre la pinza lateralmente da sotto l'IoN.
- Estrarre la legatura dalla cavità orbitale fino a quando entrambe le estremità della legatura sono più o meno equidistanti dall'IoN.
- Fai un "nodo scorsoio" dalle due estremità della legatura per consentire un perfetto controllo del grado di costrizione e fai scorrere il nodo contro l'IoN. Far scorrere ulteriormente il nodo per restringere l'IoN in modo che il diametro del nervo si riduca di una quantità appena percettibile. Fai un nodo normale sopra il nodo scorsoio in modo che la quantità di costrizione rimanga costante (ad esempio., per evitare che il nodo a fessura scivoli).
- Tagliare le legature in modo da lasciare circa 2 mm di estremità libere dal nodo.
- Ripetere la stessa procedura (passaggi da 2.11 a 2.15) per eseguire una seconda legatura a 2 mm di distanza dalla prima.
- Per la chirurgia fittizia, eseguire i passaggi da 2.2 a 2.10.
- Chiudere l'incisione del cuoio capelluto utilizzando suture in poliestere (4-0) e lasciare che il ratto si riprenda su un tampone riscaldato. Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubita sternale e non riportare l'animale in compagnia di altri animali fino a quando non si è completamente ripreso.
- Per evitare effetti analgesici preventivi sullo sviluppo del dolore neuropatico, non somministrare analgesia per il dolore post-chirurgico.